永生化小鼠胚胎肝基质细胞支持人胚胎干细胞生长的研究

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1、江苏大学硕士学位论文永生化小鼠胚胎肝基质细胞支持人胚胎干细胞生长的研究姓名：胡三强申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：胡嘉波20120607江苏大学硕士学位论文摘要目的建立永生化小鼠胚胎肝基质细胞系(Ca名为KM3)并研究其生物学特性，评价永生化小鼠胚胎肝基质细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞(humanembryonicstemcalls，hESCs)生长的潜能。方法取胎龄为13．5d昆明种胎鼠，用胰酶消化法体外分离培养小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast．

2、MEF)和小鼠胚胎肝基质细胞：采用形态学、生长曲线及细胞化学染色法分析永生化小鼠胚胎肝基质细胞的生物学特性；丝裂霉素一C处理的饲养层细胞用于人胚胎干细胞的传代、培养；应用形态学、增殖率实验、碱性磷酸酶和过碘酸．雪夫染色等方法评价人胚胎干细胞(SHhES2)未分化特性和增殖潜能；RT-PCR分析人胚胎干细胞的Oct-4、Nanog、Sox．2和ALP等基因表达情况；用R显带技术对永生化小鼠胚胎肝基质细胞饲养层上的人胚胎干细胞染色体进行核型分析；拟胚体形成实验及小鼠畸胎瘤形成实验研究人胚胎干细胞的全能性

3、。结果小鼠胚胎成纤维细胞和永生化小鼠胚胎肝基质细胞均呈成纤维样细胞形态，永生化小鼠胚胎肝基质细胞增殖速度快且营养要求低，碱性磷酸酶、过碘酸．雪夫和过氧化物酶染色结果均为阴性，其在体外已培养至129代，增殖速度及形态学特征未发现明显改变，也无明显的老化现象；永生化小鼠胚胎肝基质细胞经丝裂霉素一C处理后不再增殖，且细胞生长状态良好；人胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞和永生化小鼠胚胎肝基质细胞两种饲养层上的增殖速度无明显的区别，都呈典型的未分化形态，碱性磷酸酶和过碘酸一雪夫染色均为阳性：RT-PCR分析显示

4、，两种饲养层上的人胚胎干细胞均表达Oct-4、Nanog、Sox．2和ALP等基因；永生化小鼠胚胎肝基质细胞饲养层上的人胚胎干细胞具有正常的46，XY二倍体核型；两种饲养层上人胚胎干细胞均能形成拟胚体；永生化小鼠胚胎肝基质细胞饲养层上的人胚胎干细胞植入SCID小鼠皮下能形成典型的畸胎瘤，畸胎瘤中具有内、中、外三个胚层的组织细胞；人胚胎干细胞已在永生化小鼠胚胎肝基质细胞饲养层上稳定地传代培养96代，仍呈典型的未分化状态。结论永生化小鼠胚胎肝基质细胞系具有增殖速度快，营养要求低，呈成江苏大学硕士学位论文

5、纤维样细胞的特点，可作为饲养层细胞支持人胚胎干细胞的生长，人胚胎干细胞保持自我复制功能及全能性，永生化小鼠胚胎肝基质细胞为人胚胎干细胞工程研究提供了简便、稳定、经济的饲养层细胞。关键词小鼠胚胎成纤维细胞胚胎肝基质细胞，人胚胎干细胞，饲养层，永生化H江苏大学硕士学位论文ABSTRACTObjectiveTocreatimmortalizedmousefetalliverstromalcellline(namedKM3),identifyⅡleirbiologicalcharacteristicsand

6、examinewhetherKM3couldbeusedasfeederstosupportthegrowthofhumanembryomcstemcells(hESCs)．MethodsMEFandmousefetalliverstromalcellswereisolatedbytrypsiIl／EDTAdigestionfromtheKunMingmouseembryosat13．5dayspostcoitus．BiologicalcharacteristicsofKM3wereanalyzed

7、bymorphology,cellgrowthcurveandcytochcrnicalstaining．MEFandKM3whichWastreatedwithmitomycin-CwereusedasfeedertosupportthegrowthofhESCs．BiologicalcharacteristicsofhESCs(SHhES2)thatculturedonMEFandKM3wereanalyzedbymorphology,ratioofexpansionandALPandPASst

8、aining．TotalRNAofcellswereabstractedandtheexpressionofhESCs-relatedgeneswereexaminedbyRT-PCR，suchasOct-4，Nanog，Sox-2andALEKaryotypeanalysisWasperformedonthehESCsthatculturedonKM3byRbanding,PluripotentofhESCswereanalyzedbycmbryoidbodiesa