枳ptrbhlh基因的抗寒功能鉴定

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1、华中农业大学硕士学位论文枳PtrbHLH基因的抗寒功能鉴定姓名：张倩申请学位级别：硕士专业：果树学指导教师：刘继红201206枳励吻记劈基因的抗寒功能鉴定摘要鉴定抗逆基因是柑橘基因工程的关键，本实验室从枳中克隆了一个受低温诱导的基因Ptrbl-勉H,该基因超表达可以提高烟草和柠檬的抗寒能力。为进一步研究其抗寒功能，本研究通过农杆菌介导的遗传转化将Pn'bHLI-I-剧Vdi基因及Ptrbl-勉H分别转入枳(PondrustrifoliataL．Raf)和柚(Citrusgrandis(Lima．)Osbeck)中，并分析转基因植株的抗寒性。主要的结果如下：1．对忍

2、砀舷良足剃，基因转化枳再生系做了PCR鉴定，得到30株阳性植株。从中选取5个系和WT进行了半定量表达分析，发现Ptrbl-勉H基因在捍5、≠≠7表达量明显低于未转化系。酶活性测定结果表明，jfj}5和≠}7两个转基因系POD和CAT酶活性低于未转化系。黑暗条件下0*C处理后，从表型上看，撑5和捍7比对照受低温危害轻；电导率测定结果显示，≠}5和≠}7明显高于对照；DAB染色结果显示撑5和j

3、j}7染色深度明显高于未转化系，说明转基因株系积累了较多的H202。低温处理后酶活性测定结果显示，撑5和≠f7POD活性低于未转化系。2．PCR鉴定Ptrbl钇H基因转化柚株系

4、，获得4个阳性转基因株系，Ptrbl勉H基因在存2和#17中超表达。黑暗下4℃低温处理后，发现未转化植株的叶片比转基因系(撑2和≠≠17)萎蔫严重。电导率测定结果显示，舵和#17明显低于未转化植株，说明前者受低温伤害程度低。DAB染色实验显示{!i}2矛I#17染色深度低于未转化植株，说明转基因株系积累较少的H202。关键词：枳，低温，抗寒基因，RNAJ，过氧化物酶，活性氧，PtrbHLH华中农业大学2012届硕士研究生毕业论文AbstractThekeytocitrusgeneticengineeringistheidentificationofstressre

5、sistancegenes．Thegene，Ptrbl勉H,wasinducedbylowtemperature．ThecoldtolerancewereimprovedwhenthePtrbl-勉HgeneWaSoverexpressedintobaccoandlemon．Inthisstudy,P抒bhLH二R．NAiandPtrbHLHwereintroducedintothetrifoliateorange(PoncirustrifoliataL．Rat)and—pomelo(Citrusgra#dis(Linn．)Osbeck)viaAgrobacter

6、ium-mediatedtransformation，inordertofurtheridentifyofthefunctionofPt而}乜H试coldresistance．Themainresultsaleasfollows：1．ThirtypositivetransgenicplantswereidentifiedbyPCRinponcimslransformedwithPt施}童LHlRNAi。RT-PCRanalysisshowedthattheexpressionlevelofPtrbtKHintheselectedlransgeniclines@5a

7、nd群7)werelowerthaninWT．EnzymeassayresultsshowedthatPODandCATenzymeactivityintwotransgeniclines饼5and捍7)WaSsignificantlylowerthanWT．With0℃bwtemperaturetreatment，}

8、}5andjfj}7exhibitedworsewiltingthanWT．Conductivitymeasurementresultsshowedthatj[j}5andjfi}7weresignificantlyhigherthanⅥ呵．DAB

9、stainingresultsshowedthatthestainingofthetransgeniclinesjfj}5andjfi67wasstrongerthanWT，indicatingthatthetransgenicplantsaccumulatedmoreH202．Enzymeassayresultsshowedthattreatmentatlowtemperature．PODactivityinthe撑5and群7waslowerthanWT．2．FourpositivetransgenicplantswereidentifiedbyPCRingr

10、apefi