血浆循环dna变异在预测肝癌肝移植预后中的价值研究

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1、复旦大学硕士学位论文血浆循环DNA变异在预测肝癌肝移植预后中的价值研究姓名：胡捷申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：周俭2012-04-03血豫?瞎环DN^变异在预游肝癌肝移捆I预后中的价值研究血浆循环DNA变异在预测肝癌肝移植预后中的价直研究中文摘要肝细胞肝癌(HCC，以下简称肝癌)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，多发于东南亚及非洲，病毒性肝炎及黄曲霉毒素是目前已明确的致癌高危因子。近年来，由于丙肝的流行，欧洲及北美的肝癌发病率呈上升趋势。在我国，肝癌是第二位肿瘤杀手，每年30余万人死于肝癌，全世界每年的新发病例55％来自中国【l】。手术切除是肝癌的首选治疗方式。但80％肝

2、癌发生在病毒性肝炎的基础上，肝炎肝硬化导致的肝功能不全常常使患者失去手术机会。肝移植能彻底切除肿瘤并修复肝功能，成为肝癌合并肝硬化根治性治疗的理想治疗方法【2】。然而，供体的紧缺限制了肝癌肝移植的临床推广。为了有效的利用有限的供肝，在移植术前对肝癌患者进行预后评估对合理分配供肝有重要意义。肝癌的发生发展是癌基因及抑癌基因改变、累积的结果。癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是肝癌发生发展的重要因素13】。我所前期的研究发现促使肝癌转移的基因改变发生在原发肿瘤阶到41。因此寻找与肝癌转移复发相关的遗传学改变并应用于肝癌肝移植预后判断具有可行性。基于芯片的高通量单核苷酸多态性分析使全

3、基因组范围的遗传分析成为可能。单核苷酸多态性(SNP)是基因组中最常见的遗传学变异，是第三代遗传学标志。相对于第二代遗传学标记微卫星重复序列，SNP具有数量巨大、稳定性强和适于高通量扫描的优点【51。有文献报道肿瘤组织来源的DNA某些sNP位点基因型频率与正常组织来源的DNA基因型频率不相刚6

4、。但是，肿瘤组织的DNA只能在术后或术前穿刺活检获得，这使得其临床应用受到限制。有研究发现肿瘤来源的DNA能在肿瘤患者外周血(血浆／血清)中检测到17、8、引。Diehl等发现结肠癌患者的循环DNA可以用来监测手术治疗的效果【lo】。我所牛旗等在肝癌病人的血浆循环DNA中检测到被认为对乳

5、腺癌转移复发有预测价值的D14S51和D14S52两个微卫星标志的杂合性缺失(10ssofheterozygosity，LOH)，并认为其与肝癌病人的转移复发密切相判¨J。本课题拟在我所前期研究的基础上，利用高通量SNP芯片、飞行质谱的方法，探索血浆循环DNA分子遗传学变异(主要是SNP)在肝癌肝移植患者术后转移复发预4测中的价值，以期为现有肝癌肝移植适应证的进～步完善提供简便、有效的检测指标；同时建立相应的数学预测模型，推动肝癌肝移植病例筛选的进一步合理化；亦有助于移植术后个体化防治措施的开展。第—部分肝癌肝移植患者肿瘤组织DNA的芯片杂交及转移复发相关sNP位点的筛选目的：

6、通过卧巾芯片扫描肝癌肝移植患者肿瘤组织DNA，研究肝癌患者基因组遗传特征并筛选出转移复发相关的SNP位点。方法：将所有入选的肝癌肝移植病例分为复发组及未复发组，从每组中分别随机挑选出15例。将FFPE组织切片后(10um)在显微镜下获取较纯的肿瘤细胞(>80％)。用QIAampDNAFFPETissueKit试剂盒提取基因组DNA。M印pingPCRtest检测基因组DNA质量。通过质控的样本经DNA扩增后取500ng进行A厨metrixSNP6．O芯片检测。利用GenotypingConsole3．0．1软件进行genotyping分析。Cochnan-Armitagetre

7、ndtest统计在复发和未复发两个组中SNP基因型分布的差异，ClustersoRwlre(version3．O)和TreeViewso腑are(version1．0．13)进行聚类分析。结果：通过分析发现1272个SNP位点的基因型在复发及未复发组中分布存在差异(P

8、因型相关，SNP基因型可能是一种潜在的肝癌肝移植预后的预测指标。血浆循闯：蹦^变异在预测肝癌肝移植日媚中的价值研究第二部分转移复发相关sNP位点在循环DNA中的进一步筛选及验证目的：应用时间飞行质谱技术对肝癌肝移植患者术前血浆循环DNA进行SM，分型，进一步验证第一部分中发现的SNP位点与肿瘤转移复发的关系。方法：选取2003年到2006年间在我院行肝癌肝移植的连续病例102例。抽提患者术前血浆循环DNA。利用美国Sequenom公司的MassAR凡≮Y系统对第一部分筛选出的转移复发相关SN