腺苷受体a1和a2a相互作用对缺血性脑损伤的影响

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1、第三军医大学硕士学位论文腺苷受体A1和A2A相互作用对缺血性脑损伤的影响姓名：王皓香申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：范文辉201205第三军医大学硕士学位论文腺苷受体A1与A2A相互作用对缺血性脑损伤的影响摘要背景：随着人口的不断老龄化，脑血管疾病的风险因素如糖尿病逐年增加，缺血性脑血管病的发病率呈现出逐年上升的趋势，且致残率高，给每一个家庭带来巨大的经济和心里负担。尽管各国的神经科学界投入大量精力进行该类疾病的相关研究，但就缺血性脑血管病的神经保护方面，至今尚无确切有效的方法真正通过临床试验成为能让脑梗死患者获益的治疗手段，这其中就包括氧自由基清除剂、钙离子拮抗剂、谷氨酸受体抑制剂

2、等。因此我们在探索新的缺血缺氧性脑损伤的神经保护治疗途径显得非常必要，也非常紧迫。腺苷(Adenosine，ADO)作为一种神经递质和调质，广泛分布于神经系统、心血管系统、肾脏、胃肠道等组织，调节着各种重要的生理功能。ADO通过与其特异的受体A1R、A2AR、A2BR和A3R结合，参与了多种神经系统疾病的病理生理过程。在ADO的四种受体中，AiR和A2AR在脑内的分布及数量明显多于另外两种受体，且与ADO的亲和力也更强。既往的研究发现，ADO作为一种重要的神经递质，其神经保护功能是通过激活其抑制性受体A1产生的，并证明A1受体激活产生的神经保护作用与抑制了谷氨酸介导的兴奋性毒性有关n屹1。在正

3、常情况下，ADO生理浓度仅为40nmol／L一400nmol／L：研究发现在脑供血不足和缺氧性等损伤后脑内细胞突触间隙外液中腺苷水平明显升高(达正常时200倍以上)，并作用于受体发挥其调节作用，与此同时以谷氨酸为代表的兴奋性氨基酸的浓度也急剧升高，并启动了脑缺血后一系列病理生理过程最终导致了神经细胞的坏死或凋亡口叫1。而在本课题组在前期的实验中发现，腺苷A2A受体基因敲除后能显著减少脑缺血／再灌注区细胞外的谷氨酸浓度，并改善神经功能，减少脑梗死体积啼1，但确切机制尚未阐明。可以看出，在脑缺血状态下急剧增加的ADO并没能通过激活A1受体起到保护神经元的作用。反之，在脑缺血／再灌注后A2AR激活并

4、抑$1]AIR可能是导致脑缺血损伤的重要原因。因此我们假设，A2AR与A1R间存在相互拮抗作用，在脑局灶缺血条件下，腺苷A2A受体表达增加并抑制了A1R的功能，当阻断A2AR后产生的缺血性神经保护作用，与其激活或保护了Al受体功能有关，并抑制了谷氨酸介导的兴奋性毒性级联反应。既往研究还发现，在中枢神经系统中，谷氨酸转运体负责向细胞第三军医大学硕士学位论文内转运谷氨酸。在谷氨酸转运体各亚型中，GLT一1主要分布于纹状体区等前脑的神经胶质细胞，承担转运细胞间隙中谷氨酸的主要任务。前期的预实验发现大鼠MCAO模型使用腺苷A2A受体抑制剂(SCH58261)所起到的神经保护作用与缺血区GLT一1增加有

5、关，减轻神经元的损伤及兴奋性递质的传递哺1。由此，本课题计划从影响GLT一1及腺苷A1表达的角度深入探讨A1一A2A受体相互作用对小鼠脑缺血／再灌注损伤诱导的谷氨酸释放增加调控的分子机制。本实验以腺苷A2A受体基因敲除小鼠大脑中动脉缺血2小时／再灌注22小时模型作为研究对象，观察A2AR基因敲除对AIR表达的影响；从整体水平观察激活或抑制AIR功能对A2AR缺失后神经保护作用的影响，并观察缺血／再灌注区GLT一1表达的变化，试图揭示腺苷受体的缺血性神经保护的可能机制，为开拓缺血性神经保护治疗的新途径提供实验依据。方法：以腺苷A2AR基因敲除小鼠作用研究对象。采用PCR扩增方法鉴定小鼠基因型，并

6、筛选出实验所需的腺苷受体A2A基因敲除小鼠(A2AR／KO)与同窝野生型小鼠(A2AR／WT)制备成MCAo模型，采用免疫荧光法及Western-blot方法检测缺血／再灌注区(纹状体区)AIR表达变化；制备MCAo前检测各组小鼠正常，分别给予腺苷Al受体拮抗剂DPCPX及激动剂CPA处理各组小鼠，观察缺血2小时／再灌注22小时后每组小鼠神经功能缺损程度及脑梗死体积的变化、采用免疫印记法、Western—blot方法检测各组小鼠在MCAo缺血2小时／再灌注22小时后各组小鼠缺血／再灌注区(纹状体区)GLT-1的表达情况。结果：1．缺血／再灌注后，腺苷A2A受体缺失增加了A1受体的表达(1)We

7、sternBlot：腺苷A2A受体基因敲除小鼠(A2AR／KO)与野生型小鼠(A2AR／WT)分别制作成MCAo缺血2小时与缺血2小时／再灌注22小时模型，假手术组KO小鼠与wT小鼠纹状体区Al表达无明显差异；在缺血2小时以后A2AR／WT与A2AR／KO组比较，A1的表达未见明显差异；缺血2小时／再灌注22小时后，WT组小鼠Al表达下降，而KO组小鼠A1表达明显升高。(2)免疫荧光：腺苷A2A受