亚硒酸钠诱导胰腺癌panc-1细胞凋亡与其机制的探讨

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1、温州医学院硕士学位论文刖言胰腺癌是胰腺的恶性肿瘤，近年来其的发病率有明显增高的趋势，己成为最常见的恶性肿瘤之一。胰腺癌早期症状不明显，患者就诊时往往处于疾病中晚期，直到目前，手术治疗仍是胰腺癌病人最主要的治疗手段，但术后并发症重，预后差，其平均生存期短。90％的病人在诊断后一年内死亡，5年生存率近1％～3％。因此，医学研究更倾向于使用化疗药物治疗该肿瘤，积极探寻新的有效的化疗药物越来越显得迫切而必要。肿瘤的发生与细胞增殖和凋亡的平衡有密切关系，肿瘤的形成与迅速成长是癌细胞增值旺盛与凋亡减少的结果。近年来的研

2、究显示多种药物可诱导胰腺癌细胞的凋亡，通过调节细胞凋亡过程的不同环节，进而诱导细胞凋亡。这不仅为肿瘤的治疗提供了新的方法，同时也为药物的研究开辟的新的途径和方向。硒作为唯一受人体基因调节的必需的微量元素，与机体很多生理功能有着密切关系，硒及其化合物主要是通过不同硒蛋白而发挥代谢调节作用，且硒蛋白广泛存在于自然界中，在人体中目前发现硒蛋白家族中，以含有硒代半胱氨酸为共同特点，近年研究发现，一些含硒小分子化合物能帮助哺乳动物细胞抵御各种环境刺激，并能有效抑制肿瘤发生发展。关于SSE在防治肿瘤的报道已有很多，可以

3、诱导白血病【1]，大肠癌细胞【2]，人骨肉瘤细胞[3】，乳腺癌【4]，宫颈癌[5】，前列腺癌【6】等肿瘤细胞的凋亡，但硒对胰腺癌细胞生长的影响尚未有报道。且硒对细胞凋亡的作用机制包括细胞毒作用，调节细胞代谢及影响癌基因及抑癌基因的表达，以及对机体免疫系统的影响和细胞因子的影响，但对其诱导胰腺癌凋亡的机制尚未有过报道。为明确硒对胰腺癌细胞的生长影响及是否具有抑制生长、诱导凋亡的作用而开展本课题研究。本研究以体外培养胰腺癌PANC—l细胞作为研究对象，观察SSE对其的杀伤作用，并通过检测ROS、线粒体膜电位、C

4、aspase蛋白及细胞色素C在其诱导胰腺癌细胞凋亡过程中的表达及含量变化，以阐明SSE是否具有诱导胰腺癌细胞株凋亡及诱导凋亡的初步机制。这将可能为胰腺癌的化疗提供新的有效药物，将有助于提高胰腺癌患者的疗效。温州医学院硕士学位论文材料与方法一、材料1、细胞株人胰腺癌细胞株PANC一1，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，本实验室得以培养、传代。2、药物亚硒酸钠(SodiumSelenite，SSE)是微量元素硒的无机盐化合物，分子式Na。SeO。，易溶于水，本实验所用SSE质量分数99％，购自美国S

5、igma公司，先溶于少量PBS溶液中，配制成浓度为20mmol／L，-20℃避光保存备用。使用时溶于不含血清的DMEM培养基中。3．主要试剂试剂名称试剂公司2’，7’一二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH—DA)Sigma公司N一乙酰半胱氨酸(N—acetylcysteine)Sigma公司DMEM培养基Gibco公司PBS缓冲液Gibco公司0．25％胰蛋白酶Gibco公司MTT试剂盒Solarbio北京公司AnnexinV-FITC／PI凋亡分析试剂盒联科生物技术有限公司DNAladder提取试剂盒碧云天公司J

6、c-1线粒体膜电位检测试剂盒BestBio一贝博生物公司人Caspase一3ELISA定量试剂盒上海西唐生物公司Trizol细胞裂解液Invitrogen公司SYBRGreenIRoche，USA2×TaqPCRMasterMix天根生化科技(北京)有限公司cDNA逆转录试剂盒Fermentas公司琼脂糖BBI公司Goldview北京赛百盛基因技术有限公司DNAMarkerFermentas公司细胞裂解液碧云天公司lOOMmPMSF碧云天公司总蛋白提取试剂盒BestBio一贝博生物公司线粒体蛋白提取试剂盒P

7、ierce公司温州医学院硕士学位论文BCA蛋白分析试剂盒SDS—PAGE凝胶配制试剂盒5×SDS上样缓冲液PVDF膜吐温(Tween-20)脱脂奶粉丽春红(PonceauS)ECL发光试剂盒X一胶片显影液定影液兔抗人多克隆抗体CytC辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgGB—actin抗体氯仿(分析纯)异丙醇(分析纯)乙醇(分析纯)cytC—匕捞}弓I物：57一TTGGCAATCCGTCATCATA一37—F游弓I物：57一CCCGACAGTGCCTAGAAGAG一37GAPDH上游弓J物：57一GAGTCAAC

8、GGATTTGGTCGT一37]i游弓l物：57一TTGATTTTGGAGGGATCTCG一374、主要仪器设备SW-CT-IF型单人双面净化工作台恒温培养箱台式超速冷冻离心机EOS400Ddigital摄像机纯水仪电子天平流式细胞仪(FACSCalibur)全套琼脂唐凝胶电泳装置凝胶成像分析系统全套蛋白电泳装置电转仪Pierce公司碧云天公司Pierce公司Millipore公司Sigma公司光明乳业股份有限公