嗅鞘细胞移植延缓rcs大鼠视网膜色素变性进程的研究

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1、第三军医大学博士学位论文嗅鞘细胞移植延缓RCS大鼠视网膜色素变性进程的研究姓名：霍姝佳申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：阴正勤201205第三军医大学博士学位论文嗅鞘细胞移植缓解RCS大鼠视网膜色素变性进程的研究木摘要视网膜色素变性(retinitispigmentosa，RP)是一组以感光细胞或视网膜色素上皮(retinalpigmentedepithelium)功能异常为表现的遗传性致盲性眼病，目前临床上尚无有效的方法来阻止或逆转其退行性改变。近年来对视网膜色素变性疾病的临床及基础研究取得一定进展，细胞移植作为视网膜变性疾病的再生性疗法为治疗开

2、劈了新的途径。然而，诸如千细胞、色素上皮细胞等成体细胞移植，因存在供体细胞来源、免疫排斥、伦理等多种问题限制了其进一步的研究和应用。在RP过程中，发生了一系列复杂的形态和功能变化。原发于RPE吞噬功能障碍的RP，由于脱落的盘膜堆积在视网膜下腔，导致光感受器细胞外节代谢异常，从而引发光感受器细胞死亡，并累及内核层，继而引起大范围视网膜神经元的凋亡、坏死及突触重构4。Mtiller细胞在正常视网膜中具有参与视网膜糖代谢、调节视网膜血流、参与神经递质循环、调节视网膜水电解质平衡、参与感光色素循环过程及控制神经元兴奋性等功能。在视网膜色素变性早期，Mfiller

3、细胞活化、增殖，向外迁徙并在视网膜下间隙形成胶质瘢痕，使残存的视网膜无法从色素细胞和脉络膜获得营养因子和生存支持，光感受器细胞和神经元逐渐死亡，完全阻断了感光细胞外节的再生。同时，Mtiller细胞在增殖过程中表达了一系列表面抑制分子，抑制了正常的组织修复和神经再生3，200RP的神经元丢失和胶质增生与中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)损伤的病理过程非常相似。CNS受损后，以星形胶质细胞为主的胶质细胞在受损部位形成胶质瘢痕，阻碍了神经轴突的再生。近年来嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells，OECsl移

4、植治疗神经损伤和神经系统退行性病变疾病是医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点5。有研究认为OECs的修复作用是在嗅成纤维细胞(olfactorynervefibroblasts．ONFs)的协同作用下实现的14。移植的OECs打破胶质瘢痕的阻挡，引导再生的轴突进入CNS，从而与靶器官形成新的功能连接。OECs是目前唯一一种在成熟阶段还有生长能力的特殊类型的神经胶质细胞，广泛分布于嗅黏膜、嗅神经和嗅球的表面两层(嗅+本课题获国家自然科学基金重大国际合作项目(批准号30910103913)及重点项目(批准号81130017)资助6第三军医大学博士学位论文神

5、经纤维层和嗅小球层)6-8具有可自体移植的优势，是细胞移植修复中枢神经系统损伤中很有希望的种子细胞之一弘”。近年来OECs在视网膜疾病和视神经创伤治疗方面的应用已有报道”。19。其可以包绕视网膜节细胞(retinalganglioncell，RGC)的轴突，延缓受损的RGC的坏死，并促进视神经轴突的再生。然而目前OECs在RP治疗方面的应用还未见报道。综合上述的研究背景以及我实验室的前期研究结果，我们提出假设：嗅鞘细胞移植抑制Mnner细胞所形成的胶质瘢痕，保护视网膜神经元，从而延缓RP的视网膜退行性变进程。针对以上假设，本研究采用OECs／ONFs混合

6、细胞(由于ONFs只是OECs的支持成分，所以以下简称OECs)在体移植技术，利用经典视网膜色素变性模型RCS大鼠，对比嗅鞘细胞移植后移植组、伪手术组和对照组视网膜的结构和功能变化。并初步探讨了OECs的作用机制。主要内容及研究结果如下：l、嗅鞘细胞离体和在体的生物学特性研究。通过原代培养法获得大量的嗅鞘细胞和嗅球成纤维细胞的混合细胞，经巩膜外路法移植入30天龄的RCS．P+大鼠视网膜下腔。结果显示，移植后OECs呈多样化的伸展形态，在移植后1周、3—4周和6．8周三个时间点，移植细胞大量存活，细胞总数在移植后3．4周数量最多，6．8周时数量下降。移植细

7、胞在视网膜下腔移植点向周围逐渐迁移，并向视网膜内层迁移。而在术后4周和8周两个时间点，同样方法移植入正常大鼠视网膜下腔的OECs未见明显迁移。结果提示：OECs可在变性的视网膜环境中生存和迁移，其迁移能力与视网膜环境密切相关。2、将表达绿色荧光蛋白的_QECs移植入RCS大鼠视网膜下胃垄，于移植后4周、8周、12周三个时间点观察视网膜的形态和功能变化。结果显示，OECs移植组Miiller细胞的增殖被抑制，其在视网膜下腔形成胶质瘢痕的面积减少，Westernblot蛋白定量提示，其增殖相关蛋白GFAP表达的水平较伪手术组相比有显著下降；视网膜感光神经元的

8、凋亡被抑制，神经元的数量显著高于伪手术组和对照组，且感光细胞的形态优于伪手术组和