蛇根木perakine还原酶及其突变体的表达、酶特征、结晶及复合物三维结构研究

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1、浙江大学硕士学位论文蛇根木Perakine还原酶及其突变体的表达、酶特征、结晶及复合物三维结构研究姓名：陈艺欣申请学位级别：硕士专业：药物化学指导教师：JoachimStǒckigt20120306浙江大学硕士学位论文摘要夹竹桃科萝芙木属药用植物蛇根；K(RauvolfiaserpentinaBenth．eXKurz)，富含生物碱类化合物，具有降血压、抗心律失常、退热、抗癫、治虫蛇咬伤等功效，其主要活性成分为阿吗灵、阿吗碱和利血平．对其次生代谢产物生物合成网络的研究是进一步开发利用该药用植物，调控生物代谢方向，体外表达其活性成分的基础。本论文

2、对催化蛇根木生物碱Perakine还原为Raucaffrinoline反应的Perakine还原酶(PerakineReductase，PR)进行了主要包括该酶的表达、突变、结晶及其与辅酶的三维结构的研究。课题组在前期的研究中对Perakine还原酶的生物化学特征进行了研究，发现PR为特异性依赖NADPH为辅酶进行氧化还原反应，通过序列比对和基因突变证明醛酮还原酶(A1do-KmoReductase，Ag_R)超家族的新成员，而且其底物特异性相对较低。本文的第一部分对甲基化后Perakine还原酶及其突变体进行了生物化学研究。以pQE．2质粒

3、为表达载体，在大肠杆菌M15中异源高效表达N端带有6个组氨酸标记的PR，并利用Ni-NTA亲和层析进行纯化。为得到复合物晶体，对Perakine还原酶进行突变，并确定其生化性质。为进一步深入研究Perakine还原酶的三维结构、活性位点构造及催化机制，论文的第二部分对Perakine还原酶及酶与辅酶／底物复合物进行了结晶条件的摸索及X．ray三维结构的分析。经赖氨酸残基甲基化修饰后，(His)6．PR采用气相扩散悬滴法进行结晶，优化后的结晶条件为：晶体生长温度为20"C，酶的浓度在4．5．5．0mg／ml之间，以pH7．0的O．1M柠檬酸钠为

4、结晶缓冲液，27％PEG4000为沉淀剂。所得甲基化(His)6．PR晶体为正交晶系，属于C222l空间群，晶胞参数为a-58．796A，b=93．042A，c=142．997A，a-----胪丫：90，每个不对称单元中包含一个酶分子。对Perakine还原酶突变体和NADPH进行共结晶，得到晶体为属于P3221空间群，每个不对称单元中包含一个酶分子。采用分子置换法对数据进行解析，经修正最终PR三维结构模型的I～破因子和Rk因子分别为19．O％和24．7％，分辨率为2．30A。V浙江大学硕士学位论文摘要得到P蛐e还原酶与众不同的为a8／p6桶

5、状O'IM桶状)结构，并且发现在结合NADPH后P幽e还原酶的构象发生改变，使得底物结合位点得以显现，从而得到了PR辅酶与底物的结合位点及其催化机制。关键词：Perakine还原酶；醛酮还原酶；功能性表达；吲哚生物碱次生代谢网络；蛇根木(夹竹桃科)；酶结晶；三维结构VI浙江大学硕士学位论文AbstractABSTRACTThetherapeuticalusageofthemedicinalplantRauvolfiaserpentina(Benth．exKurz)(Apocynaceae)includesforinstancethetreat

6、mentofhypertension，fevers，snakebitesandinsanity．R．serpentinadelivershighyieldsofalkaloidswhichbelongtOthemonoterpenoidindolealkaloidsfamily．Themajorconstituentsoftheplantrootarereserpine，ajmalicineandajmaline．Elucidationofthemetabolicnetworkallowsabetterunderstandingandutil

7、izingthisplant，steeringthepathwayintothedirectionofadesiredproductbyblockingspecificenzymeswithinhibitorsorknockingoutthecorrespondingeDNA,andreconstructingtheartificialbiosyntheticpathwayinefficientprokaryoficsystems．ThisthesisiscarriedOUtforthedetailedinvestigationoftheR．

8、serpengnaenzymeperakinereductaseif,R1whichcatalyzes鼬NADPH—dependentconversionfromp