若干钙调控蛋白在小鼠es细胞衍生神经元内质网钙储存及神经发生中的作用

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1、浙江大学硕士学位论文若干钙调控蛋白在小鼠ES细胞衍生神经元内质网钙储存及神经发生中的作用姓名：高益宁申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：楼宜嘉20120305浙江大学硕士学位论文摘要若干钙调控蛋白在小鼠ES细胞衍生神经元内质网钙储存及神经发生中的作用浙江大学药学院药理学专业09级硕士研究生高益宁导师楼宜嘉教授中文摘要钙离子在细胞膜和内质网(endoplasmicreticulum，ER)膜之间的流动对神经元的基础功能发挥着关键性的作用，而内质网作为胞内重要的钙储存细胞器，参与调节胞内钙平衡，调控各种信号通路，介导细胞蛋白合成、信号传导等过程。本实验以小鼠胚胎干(embryonicst

2、em，ES)细胞体外定向分化神经元为模型，模拟胚胎神经发育过程，考察若干钙调控蛋白在小鼠ES细胞衍生神经元内质网钙储存及神经发生中的作用。内质网中的钙离子动态平衡过程由兰尼碱受体(ryanodinereceptors，RyRs)、IP3受体(inositoll，4，5．triphosphatereceptors，IP3Rs)以及肌(内)质网Ca2+_ATP酶(sarcoplasmiereticulumCa2+．ATPase，SERCA)协调运作控制。其中，SERCA蛋白能量依赖性的钙回调作用对内质网钙平衡至关重要。本实验考察了ES细胞神经元分化过程中内质网钙储存及钙释放特征，并探索SER

3、CA在神经元功能性发育中潜在作用及可能的分子机制。Junctophilins(JPs)是一类被证实存在于兴奋期细胞中的Ca2+平衡调控蛋白，神经细胞表达Junctophilin3(JP．3)，Junctophilin4(JP一4)两种亚型。咖3，Je-4基因敲除小鼠特征性表现出运动协调功能失常、平衡能力损伤并伴有记忆损伤．本研究利用ES细胞体外分化为神经元模型，探索Jp-3，Jp-4在胚胎神经发育过程中的作用。III浙江大学硕士学位论文摘要第一章SERCA在小鼠ES细胞衍生神经元内质网钙储存以及神经突起发育中的作用日的：探索小鼠胚胎干细胞神经分化过程中内质网钙储存及钙释放特征，并探索内质

4、网钙泵蛋白SERCA在神经元功能性发育中潜在的作用。方法：采用经典的444+法诱导小鼠ES细胞定向分化为神经元，107mol／L全反式维甲酸(Retinoicacid，RA)为阳性对照，0．1％二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照。在分化培养终点(贴壁铺展培养d8+10)，光镜和免疫荧光成像法鉴定神经元形成(轴突长度是胞体长度的3倍及以上)，细胞微管蛋白(IB-mbulinlII)阳性。分别收集ES细胞、拟胚体(embryoidbodies，EBs)，贴壁培养d8+0、d8+5和d8+10细胞样本，以RT-PCR及Westem．blot法，评价内质网相关钙调控蛋白RyRs、IP3受体及SER

5、CA在各个神经分化时期表达特征。以神经前体细胞标志蛋白(nestin)，成熟神经元标志蛋白(13-tubulinlll)，神经轴突标志蛋白(neurofilaments，NEFM)和神经树突标志蛋白(microtubule—associatedprotein2，MAP2)表达评价分化情况；FMl．43荧光染色观察分化成熟神经元囊泡摄取功能。选取分化早期d8+3神经前体细胞及d8+10分化成熟神经元，经由活细胞工作站检测其内质网钙释放功能。以10曲mol／LSERCA抑制剂(cyclopiazonicacid，CPA)论证SERCA对神经分化的特定作用。观察CPA是否影响RA促神经分化作用

6、及神经元囊泡摄取功能。同时利用Western-blot法检测MAPK通路中ERK，INK，p38磷酸化等相关分子事件的变化，以探索RA促神经分化过程SERCA的可能机制。结果：小鼠ES细胞定向分化神经元过程中，内质网钙相关蛋白SERCA、l坶Rs和IP3Rs表达均随分化时相依赖性上调．神经前体细胞即具有内质网钙释放功能，成熟神经元中此功能进一步增强。SERCA抑制剂CPA能显著减少RA促ES细胞分化为神经细胞，抑制神经元轴突和树突发育，并抑制神经元囊泡摄取功能。提示SERCA具有调控神经分化作用，特别体现在促轴突和树突发育以及囊泡摄取功能。CPA可下调MAPK通路中ERK，JNK和p38

7、的磷酸化，提示内质网钙储存对神经分化调节作用尚伴随MAPK家族蛋白的激活。结论：RA促小鼠ES细胞定向分化神经过程，呈现内质网钙储存及释放功IV浙江大学硕上学位论文摘要能，该功能存在于神经细胞分化早期，且随分化进程呈上调趋势。抑制SERCA钙离子泵功能，不仅降低内质网钙储存，尚呈现抑制神经分化作用，特别是影响轴突和树突发育，并抑制了神经囊泡摄取功能。神经分化过程中SERCA活性伴有MAPK家族蛋白磷酸化参与。第二章印o，劫4基因对小