缺氧诱导因子-1α(hif-1α)的rna干扰联合经动脉化疗栓塞治疗肝癌的实验研究

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1、复旦大学博士学位论文缺氧诱导因子--1α（HIF--1α）的RNA干扰联合经动脉化疗栓塞治疗肝癌的实验研究姓名：陈呈世申请学位级别：博士专业：影像医学与核医学指导教师：王建华2012-04-01复旦大学博士论文中文摘要第一部分缺氧诱导因子．1aRNA干扰慢病毒的制备和干扰靶点评价目的。将设计的缺氧诱导因子．1a(HIF．1a)的RNA干扰靶点连接到慢病毒载体，并确定其能否有效转染McARH7777细胞，评价敲低HIF．1a的程度，选择最佳靶点用于后续研究。方法：设计4个HIF．1a的RNA干扰靶点和1个阴性对照(NC)靶点，将RNA干扰靶点分别连接到pGCSIL

2、．GFP慢病毒载体；将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，选择阳性菌落进行PCR扩增和基因测序鉴定RNA干扰靶点是否成功连接到慢病毒载体；进一步将连接有RNA干扰靶点的慢病毒载体进行扩增并进行滴度测定：应用慢病毒载体转染McARH7777细胞，将转染后的McARH7777细胞进行细胞爬片和DAPI染色确定转染效率，并进行荧光定量反转录聚合酶链反应试验，确定转染后HIF。la敲低的程度。结果：将RNA干扰靶点均连接到慢病毒载体并转化到感受态细胞，对阳性菌落进行PCR扩增，各靶点病毒载体的扩增长度分别为：NC，343bp,Targetl，347bp：Target2，

3、347bp；Target3，347bP,Target4，346bp。经基因测序中证明RNA干扰靶点均连接到慢病毒载体。成功对慢病毒载体进行扩增和滴度测定，各载体的滴度分别为：HIF．1a．LV-NC，5E+9TU／ml，HIF．1a．LV-Targetl，4E+8TU／ml；HIF-la—LV-Target2，5E+8TU／ml；HIF-la-LV-Target3，7E+8TU／ml；HIF—la-LV-Target4，7E+8TU／ml。经细胞爬片和DAPI染色确定慢病毒转染McARH7777细胞的效率均在95％以上；在各病毒转染McARH7777后，经反转录

4、聚合酶链反应试验确定HIF．1a的相对表达量分别为：Wildtype，1．01士0．09；NC，1．02士0．08,Targetl，0．50士0．13；Target2，O．23土0．13；Target3，O．714-0．10,Target4，0．824-0．1l。选择靶点Target2作为后续的实验研究的靶点。结论：HIF．1a的RNA干扰靶点能够成功连接到慢病毒载体pGCSIL．GFP；慢病毒载体pGCSIL—GFP能够转染McARH7777细胞，并有着较高的转染效率；在复旦大学博士论文中文摘要McARH7777细胞中，可以通过RNA干扰的方法敲低HIF．1a

5、的表达。关键词：缺氧诱导因子．1；肝细胞肝癌；慢病毒；RNA干扰第二部分缺氧诱导因子．1Q的RNA干扰减低缺氧肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力目的：本研究探索慢病毒调节的HIF—la的RNA干扰在缺氧的条件下能否敲低HIF．1a的表达和进一步抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达，能否抑制HCC细胞的增殖，侵袭和迁移能力。方法：应用慢病毒构建HIF．1a的RNA干扰载体感染大鼠肝癌细胞系McARH7777，在正常氧条件和缺氧的条件下进行不同时间段的培养。应用反转录聚合酶链反应和免疫印迹分别检测HIF．1a和VEGF的RNA和蛋白表达水平。通过细胞活性实验，Tran

6、swell迁移和侵袭实验分别检测细胞的增殖，迁移和侵袭能力。结果：反转录聚合酶链反应分析结果：在常氧条件下，HIF．1etRNA干扰分别使McARH7777细胞中HIF．1et和VEGF的mRNA表达水平减低76．94％和53．72％。在缺氧条件下，在HIF．1a和VEGF的mRNA表达水平最高时，对照组细胞HIF．1a和VEGF的mRNA表达水平分别是RNA干扰组细胞的3．83倍和2．90倍。HIF．1a和VEGF的mRNA表达在RNA干扰组和对照组的相关系数分别是O．84和O．83，HIF-la和VEGF无论是在RNA干扰组还是在对照组都显著相关(p<0．0

7、5)。HIF．1etRNA干扰显著抑制缺氧诱导的HIF．1et和VEGFmRNA的升高。免疫印迹分析结果：在HIF．1QRNA干扰的细胞内HIF．1a的蛋白量在常氧条件和缺氧6小时的条件下分别是对照组细胞的o．10倍和o．18倍。在HIF一1QRNA干扰的细胞内VEGF的蛋白表达量在常氧条件和缺氧6小时的条件下分别是对照组细胞的O．7l倍和O．47倍。HIF．1QRNA干扰显著抑制缺氧诱导的HIF．1Ⅱ和VEGF蛋白的升高。迁移实验结果：在常氧条件下，HIF．1ORNA干扰组穿过小室的细胞数目(35．17±8．64)显著低于对照组穿过小室的细胞数目(46．83±

8、9．50)(p<0．05