rna干扰沉默缺氧诱导因子hif-1α基因治疗骨肉瘤实验的研究

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1、华中科技大学同济医学院博士学位论文缩写词日．actillcDNADEPCdNTPEDl’AELISAFnHIF—tqHREHRPMcAbmRNAMVDPTGSRISCRNAiRT-pCRsIll姒siRNAn仆衄，VEGF缩写词表英文全称beta-actincomplementarydeoxyribonucleicaciddielthylpyrocarbonatedeoxyriboaucleosidetriphosphateethylenediaminetetra—aceticacidenzyme—linkedimmunosorbentassayfibronectinh)qpoxla-in

2、dueiblefactorlalphahypoxiaresponseelementshorseradishperoxidasemonoclonalantibodymessengerribonuelcicacidmicrovesseldensitypost-乜anseriptionalgenesilencingRNA-inducedsilencingcomplexRNAmterferencefevP．,lBetranscriptionpolymerasechainreactionsmallhairpinRNAshortinterferingRNATdT-mediatedDutpnickend

3、-labctingvascularendothelialgrowthfactor中文名称0．肌球蛋白互补脱氧核糖核酸焦炭酸二乙酯脱氧核糖核苷三磷酸乙二胺四乙酸酶联免疫吸附法纤连蛋白缺氧诱导困子．1n缺氧反应元件辣根过氧(化)物酶单克隆抗体信使RNA微血管密度转录后基因沉默RNA诱导沉默复合物RNA干扰逆转录聚合酶链式反应短发夹状RNA小分子干扰ItNATdT介导的缺口末端标记血管内皮生长因子华中科技大学同济医学院博士学位论文RNA干扰沉默缺氧诱导因子HIF一1o治疗骨肉瘤的实验研究华中科技大学同济医学院附属协和医院博士研究生：吴强导师：杨述华教授摘要一．HIF—lⅡ在骨肉瘤中的表达及意义目

4、的探讨缺氧诱导因子．1a(HIF一1n)在骨肉瘤中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学方法(SP法)，检测了48例骨肉瘤和10例正常骨组织中HIF一1a和VEGF的表达，分析两种基因表达的相关性，并对有关临床和病理指标综合分析。结果HIF—ln在骨肉瘤中表达阳性率为43．8％，而正常骨组织中均为阴性表达；HIF—ld和VEGF基因表达之间显著正相关(x2=4．769。P=-0．029)；HIF一1Ⅱ的表达与年龄、性别、肿瘤的体积大小、Dahlin分型无关(踟．05)，而与骨肉瘸临床分期、软组织浸润以及Price分级密切相关(P<0．05)。结论：HIF-1d的高表达参与了骨肉瘤的恶性进展

5、，可能通过刺激VEGF表达促进缺氧环境下骨肉瘤的血管新生，可作为新的分子靶点应用于骨肉瘤诊断、基因治疗和预后判断。二．缺氧对骨肉瘤SaOS．2细胞生物学特性的影响目的观察体外缺氧条件下骨肉瘤SaOS．2生物学特性的改变。方法建立骨肉瘤细胞体外缺氧培养模型。流式细胞仪分析细胞周期改变。划痕损伤法和Boyden侵袭小室检测细胞体外侵袭迁移能力的变化。观察缺氧培养不同时相(Sh，16h，24h)}ⅡF．1Ⅱ和ⅥⅪF的表达。半定量RT-PCR方法检测HIF-1a和VE(币mRNA的转录水平，免疫组化(SP法)检测骨肉瘤细胞中HIF．1n和VEGF蛋白表达情况，～1。ISA法检测培养上清中VEGF蛋

6、白表达。结果缺氧培养16h内，划脆2华中科技大学同济医学院博士学位论文周期表现为Gl期阻滞。24小时后，细胞周期恢复常氧状态。缺氧培养24h后，骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭能力明显增强。缺氧处理后，HIF-1amRNA转录水平没有明显改变，蛋白表达升高。VEGFmRNA以及蛋白的表达在缺氧条件下均显著增强。结论骨肉瘤细胞存在缺氧耐受机制，通过一系列生物学特性的改变来应对缺氧带来的不利。兰．HIF-IQ短发夹状小RNA干扰载体的构建及鉴定目的构建低氧诱导因子}ⅡF—ln发夹状小干涉RNA真核表达载体，观察发夹状双链小干涉RNA对骨肉瘤细胞HIF一1a的转录后的基因沉默效果。方法体外合成两对互补的

7、寡核苷酸链，分别针对缺氧诱导因子HIF一1nmRNA序列的两个靶位点。退火形成双链，插入pSilencerTMneoU。2．1真核表达载体。将构建好的载体经脂质体介导转染骨肉瘤Sa0S一2细胞，观察瑚F—lⅡ基因的沉默效果。半定量RT—PCR检测}ⅡF一1amRNA的抑制程度，免疫荧光和免疫印迹(WesternBlot)检测mF一1a蛋白表达情况。结果测序证实成功构建HIF一1n发夹状小干涉RNA真核表达载体。转录生成的