日本血吸虫逆转录转座子dna诊断靶序列的筛选及其研究

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3、确诊价值，因此，核酸检测法用于血吸虫感染的诊断及疗效考核已成为近年来血吸虫病分子诊断技术的研究热点。靶序列的选择是决定核酸诊断方法敏感性及特异性的关键因素之一。本课题组前期获得的sjI也的230bp靶序列在日本血吸虫感染家兔及病人血清特异性DNA检测中显示了较好的敏感性和特异性。在此基础上，本研究通过对25个新发现的逆转录转座子DNA检测敏感性及特异性的研究，成功筛选到一段来自于逆转录转座子SjCHGCSl9分子量为303bp的靶序列，探讨了日本血吸虫核酸检测靶序列的选择依据，进一步建立了303bp靶序列的nested．PCR检测法，显示了对日本血吸虫感

4、染家兔模型的早期诊断和疗效考核价值，并评价了nested．PCR法应用于日本血吸虫病患者的诊断及疗效考核效果。同时本研究还初步建立了针对sjCHGCSl9靶序列的LAMP法，并探讨了在血吸虫感染家兔血清DNA检测中的应用价值。全文共分五个部分：第一部分25个日本血吸虫逆转录转座子DNA诊断靶序列的筛选在本课题组前期研究中发现了来源于逆转录转座子sjR2分子量为230bp的靶序列，用于检测日本血吸虫感染宿主血清DNA，显示出高度的敏感性和特异性。本研究针对日本血吸虫基因组中新发现的25个逆转录转座子设计引物，应用普通PCR方法检测日本血吸虫、曼氏血吸虫、肝

5、吸虫、肺吸虫及旋毛虫的DNA，评价不同靶序列检测血吸虫DNA的敏感性和特异性，以期寻找敏感、特异具有诊断价值的新靶序列，研究结果发现了来源于逆转录转座子SjCHGCSl9(扩增区段为2049bp一2334bp)分子量为303bp的靶序列，用于检测日本血吸虫DNA显示出高度的敏感性(最高检测敏感性21．5fg／／．tL)。该靶序列与曼氏血吸虫具有交叉反应，而与肝吸虫、肺吸虫及旋毛虫均未出现交叉反应。第二部分25个日本血吸虫逆转录转座子DNA诊断靶序列的生物信息学分析本研究对sjR2及25个新的日本血吸虫逆转录转座子的基本生物信息学数据进行分析，探讨影响日本

6、血吸虫DNA核酸检测敏感性及特异性的相关因素。采用SAS软件进行多重线性回归分析，发现日本血吸虫DNA的PCR检测敏感性与逆转录转中文摘要日本血吸虫逆转录转座子DNA诊断靶序列的筛选及其研究座予的完整拷贝数及其ESTS活跃度呈密切相关，同时还受到逆转录转座子在整个血吸虫基因组中所占的比例等其它基本生物信息学特征的影响。进一步分析发现，已获得的2个具有高度检测敏感性和特异性的靶序列(230bp币H303bp)分别来源于逆转录转座子SjR2和SjCHGCSl9，二者在日本血吸虫基因组中均具有较高的完整拷贝数(分别是400，793)，更高的部分重复拷贝数(分别

7、是23，755，17，373)及较高的ESTs活跃度(分别是79，39)，并且在系统进化树中同属于非长末端逆转录转座子的SR2家族。以上生物信息学分析结果表明，靶序列在基因组中的完整拷贝数及其ESTs活跃程度可能是决定日本血吸虫DNA检测敏感性的关键因素之一，而特异性则主要与靶序列和其它物种是否具有同源序列相关。第三部分逆转录转座子SjCHGCSl9的303bp靶序列用于日本血吸虫感染宿主早期诊断及疗效考核以逆转录转座子SjCHGCS19的303bp片段为靶序列，通过nested．PCR方法探讨其用于日本血吸虫DNA检测的敏感性和特异性，同时应用于日本血

8、吸虫不同感染度宿主外周血清的DNA检测，进一步探索该靶序列在日本血吸虫病早期诊断