同源重组敲除β-lactoglobulin基因的山羊耳组织成纤维细胞的构建

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1、西南大学硕士学位论文同源重组敲除β--lactoglobulin基因的山羊耳组织成纤维细胞的构建姓名：张楠阳申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：赵永聚20120601摘璎同源重组敲除夕．1actoglobulin基因的山羊耳组织成纤维细胞的构建动物遗传育种与繁殖硕士研究生张楠阳指导教师赵永聚副教授摘要基因敲除技术是利用同源重组，对基因组进行定点精确遗传修饰的一种方法。利用动物转基因技术和动物克隆技术，再结合基因打靶技术，人们开展了基因的定点修复、遗传缺陷的治疗、动物不利基因的敲除失活等一系列的动物基因组修饰的理论和应用研究。这些技术也为动物乳腺反应器研究

2、和提高表达率提供了重要帮助，为实现基因定点整合及乳腺特异性表达寻找到途径．无疑成为当今动物遗传学研究的热门和重点。p．乳球蛋白(}1actoglobulin。BLG)是婴儿乳过敏症的主要的过敏原之一。为了提高乳品质量，消除乳汁中BLG过敏原显得尤为重要。虽然当前有针对降低BLG过敏症的一些方法，但不能从根本上消除乳汁中的BLG，也就无法彻底地解决BLG的致敏性问题。本研究对山羊体细胞fl-lactoglobulin基因敲除进行了初步探索，研究的目的在于利用山羊BLG基因打靶载体。对山羊耳组织成纤维细胞进行定点基因敲除，然后经过脂质体转染和药物正负筛选技术，构建敲除BLG

3、基因的山羊耳组织成纤维细胞，为生产乳汁中不含BLG的山羊新品种奠定基础。本研究共分两部分，第一，利用组织块培养法分离培养山羊耳组织成纤维细胞；第二，利用构建的打靶载体，构建敲除fl-lactoglobulin基因的成纤维细胞。主要进行了：(1)利用组织块培养法分离培养山羊耳组织成纤维细胞，并进行了细胞冻存复苏，测定了细胞活率和生长曲线：(2)利用脂质体法将打靶载体pBLG2T载体转染入山羊耳组织成纤维细胞；(3)用G418和丙氧鸟苷对转染后的成纤维细胞进行了共计17d的正负药物筛选；(4)PCR鉴定筛选得到的细胞克隆；(5)比较阳性细胞和普通细胞的活力区别，并对阳性细胞

4、克隆进行核型分析．研究结果如下：1．成功分离培养了山羊耳组织成纤维细胞。冻存前细胞存活率为97．O％，经冻存复苏后的细胞存活率为92．3％。细胞的生长曲线里“S”型，依次经历了潜伏生长期、对数生长期和平台期。2．根据山羊耳组织成纤维细胞对13418的耐受分析结果和细胞生长状况，选择G418浓度400．s／mL为初筛浓度，200I_tg／mL为维持浓度，对细胞进行了7d的正筛选，然后用G418和GANC进行了10ci的负筛选，得到了12个细胞克隆。3．PCR法检测，结果显示只有l号细胞克隆有neo基因条带，并出现了预期的打靶条带，两南大学硕士学位论文初步认为该克隆发生了预

5、期的同源重组。该阳性细胞克隆细胞核型稳定，可以作为供体细胞。细胞活力显著低于普通成纤维细胞的细胞活力(1．556=1：0．026坩1．726：t：0．036．P

6、n—yangZHANGSupervisor：AssociateProf．Yong-juZHAOABSTRACT11hegencknockouttechnologyisawayofgeneticmodificationwithprecisefixed-point．Withthecombinationofgonetargeting，animaltransgenicandanimalcloningtechnologies，therehavebeenaseriesoftheoreticalandappliedresearchofanimalgenornesmodified,su

7、chasfixed-pointgenerepair,thetreatmentofgeneticdefectsandinactivationofanimalunfavorablegene．Alargenulll：befofbasicandappliedresearchgavethebasicsuppoItOilimprovementtheexpressionratesofmanmmryglandbioreactorandreducetherateofrandomintegration,whichprovidedimportanthelptO