atm基因与肝癌细胞辐射损伤修复的关系分析

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1、中文摘要DNA损伤信号传递给DNA-PK；ku蛋白激活，结合在DNA损伤区域，DNA—PKcs与ku蛋白形成一个复合体，直接参与DNA损伤修复；p53是一个关键的DNA损伤检查点蛋白【221，通过特异性转录后调节机制，p53与下游GADD45或p21相互作用，上调GADD45可以激活JNK和／或p38MAPK信号途径参与细胞凋亡，调控p21可产生细胞G1期阻滞；MDM2是p53基因负调控因子，MDM2与p53结合，通过泛素(ubiquitin)依赖的蛋白酶体(proteosome)途径降解p53；ATM对CHK2的激

2、活进一步磷酸化p53，增加p53的稳定性，Cdc25A／C使CHK2失活，阻止CDKl激活，导致细胞G2期阻滞。其它参与DSB修复有BLM、BRCAl、H2AX、Mrell、NBSl、XRCC4、Rads掣231。ATM基因是近年来研究肿瘤放射抗拒方面的一个热点基因，LIl241等证实抑制ATM基因后宫颈癌的放射敏感性有所提高，而在肝癌中此方面的研究较少。本课题组前期实验已证实ATM基因在肝癌患者中是过度表达的[2s】。本研究试图应用简单方便的siRNA干扰技术沉默肝癌细胞HepG2中ATM基因，并检测ATM表达沉默

3、后HepG2的放射生物学特征变化，以期了解辐射增敏机制，为下一步选择联合治疗措施达到更好肝癌治疗疗效提供实验依据。研究目的：1、设计并合成能高效抑制肝癌细胞HepG2中ATM基因的siRNA序列，分别存mRNA和蛋白水平检测其抑制效率。2、通过小分子RNA干扰技术抑制肝癌细胞中ATM基因的表达，检测ATM基因表达沉默前后及在经x线照射后细胞生物学特征变化。研究方法：1、设计并合成能高效抑制肝癌细胞HepG2中ATM基因的siRNA序列。用Ambion公司在线siRNA设计软件确定特异针对人ATM基因的siRNA靶序列

4、，Tnschl法设计选取3条siRNA。利用引物设计软件PrimerPremier5．0设计ATM基因定量PCR扩增引物，游：5．ACTGGCCTTAGCAAATGC．3’，下游5’．TTGCAGCCTCTGTTCGAT·3’。硕士学位论文2、观察转染效率及检测抑制效果。取指数生长期肝癌细胞HepgG2，用lipofectamine2000分别转染3条siRNA，6小时后选带荧光的cy3siRNA在荧光显微镜下观察转染情况。同时每条siRNA选取3个浓度进行最适浓度筛选实验(25nmol／mL、50nmol／mL、7

5、5nmol／mL)，逆转录，qRT．PCR确定最适浓度、时间及检测mI州A水甲。蛋白质印迹法检测删蛋白变化。3、ATM基因表达沉默对肝癌细胞细胞生物学特性的影响选取上述最高效的siRNA序列，转染肝癌细胞HepG2，通过MTT法检测ATM基因沉默后体外增殖的影响。还有转染24小时后分别给予OGy、6GyX线照射，流式细胞术检测ATM基因抑制后细胞周期、细胞凋亡的变化情况，中性彗星实验检测细胞DSB情况。结果1、有效siRNA片段的筛选利用在线数据库和软件设计ATM基因干扰片段，瞬时转染肝癌细胞后，荧光显微镜测定三条s

6、iRNA片段转染效率都能达到80％。每条siRNA取3个浓度转染进肝癌细胞HepG2中，转染12h后，从肝癌细胞中提取总RNA，测其OD260／OD280为1．96，说明无蛋白质及DNA污染：RNA电泳图显示RNA完整性较好；qRT．PCR检测siRNA浓度为75nmol／mL时抑制效率最高，达到72％。Westernblotting显示转染高效抑制ATM基因的siRN序列24h、48h的抑制率分别是70％、78％，柏较于siRNANc组及lipofectamine2000组ATM蛋白表达明显下降；而72小时后其蛋白

7、表达逐渐上升。2、ATM基因表达沉默后对肝癌细胞生物学特性的影响。选取高效抑$1JATM的siRNA片段转染肝癌细胞24h后，收集细胞，MTT法检测转染HepG2ATM、HepG2Nc组]及：lipofectamine2000=组细胞之间其增殖无明显差异(P>O．05)。转染24h后，给予X线照射，流式细胞仪检测结果显示：在未照射前，3组细胞的各期百分比未见区别，但占砂X线照射244,时后出现明显变化：V中文摘要正常HepG2细胞、HepG2Nc组细胞均形成G1、G2峰。而HepG2ATM组G：／M期细胞明显增多，S

8、期细胞所占百分比从31．8％降至11．1％(P<0．05)。细胞凋亡检测：通过AnnexinV—FITC／PI双染流式分析发现，各组细胞在未照射时无明显异常，占锣X线照射24d、时后发现正常HepG2细胞、HepG2Nc组细胞之间无明显变化(P>0．05)，但HepG2ATM组早期凋亡细胞的百分比是HepG2Nc组的2倍(P<0．05)。彗星实