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时间:2019-02-18
《atm基因与肝癌细胞辐射损伤修复的关系分析》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、中文摘要DNA损伤信号传递给DNA-PK;ku蛋白激活,结合在DNA损伤区域,DNA—PKcs与ku蛋白形成一个复合体,直接参与DNA损伤修复;p53是一个关键的DNA损伤检查点蛋白【221,通过特异性转录后调节机制,p53与下游GADD45或p21相互作用,上调GADD45可以激活JNK和/或p38MAPK信号途径参与细胞凋亡,调控p21可产生细胞G1期阻滞;MDM2是p53基因负调控因子,MDM2与p53结合,通过泛素(ubiquitin)依赖的蛋白酶体(proteosome)途径降解p53;ATM对CHK2的激
2、活进一步磷酸化p53,增加p53的稳定性,Cdc25A/C使CHK2失活,阻止CDKl激活,导致细胞G2期阻滞。其它参与DSB修复有BLM、BRCAl、H2AX、Mrell、NBSl、XRCC4、Rads掣231。ATM基因是近年来研究肿瘤放射抗拒方面的一个热点基因,LIl241等证实抑制ATM基因后宫颈癌的放射敏感性有所提高,而在肝癌中此方面的研究较少。本课题组前期实验已证实ATM基因在肝癌患者中是过度表达的[2s】。本研究试图应用简单方便的siRNA干扰技术沉默肝癌细胞HepG2中ATM基因,并检测ATM表达沉默
3、后HepG2的放射生物学特征变化,以期了解辐射增敏机制,为下一步选择联合治疗措施达到更好肝癌治疗疗效提供实验依据。研究目的:1、设计并合成能高效抑制肝癌细胞HepG2中ATM基因的siRNA序列,分别存mRNA和蛋白水平检测其抑制效率。2、通过小分子RNA干扰技术抑制肝癌细胞中ATM基因的表达,检测ATM基因表达沉默前后及在经x线照射后细胞生物学特征变化。研究方法:1、设计并合成能高效抑制肝癌细胞HepG2中ATM基因的siRNA序列。用Ambion公司在线siRNA设计软件确定特异针对人ATM基因的siRNA靶序列
4、,Tnschl法设计选取3条siRNA。利用引物设计软件PrimerPremier5.0设计ATM基因定量PCR扩增引物,游:5.ACTGGCCTTAGCAAATGC.3’,下游5’.TTGCAGCCTCTGTTCGAT·3’。硕士学位论文2、观察转染效率及检测抑制效果。取指数生长期肝癌细胞HepgG2,用lipofectamine2000分别转染3条siRNA,6小时后选带荧光的cy3siRNA在荧光显微镜下观察转染情况。同时每条siRNA选取3个浓度进行最适浓度筛选实验(25nmol/mL、50nmol/mL、7
5、5nmol/mL),逆转录,qRT.PCR确定最适浓度、时间及检测mI州A水甲。蛋白质印迹法检测删蛋白变化。3、ATM基因表达沉默对肝癌细胞细胞生物学特性的影响选取上述最高效的siRNA序列,转染肝癌细胞HepG2,通过MTT法检测ATM基因沉默后体外增殖的影响。还有转染24小时后分别给予OGy、6GyX线照射,流式细胞术检测ATM基因抑制后细胞周期、细胞凋亡的变化情况,中性彗星实验检测细胞DSB情况。结果1、有效siRNA片段的筛选利用在线数据库和软件设计ATM基因干扰片段,瞬时转染肝癌细胞后,荧光显微镜测定三条s
6、iRNA片段转染效率都能达到80%。每条siRNA取3个浓度转染进肝癌细胞HepG2中,转染12h后,从肝癌细胞中提取总RNA,测其OD260/OD280为1.96,说明无蛋白质及DNA污染:RNA电泳图显示RNA完整性较好;qRT.PCR检测siRNA浓度为75nmol/mL时抑制效率最高,达到72%。Westernblotting显示转染高效抑制ATM基因的siRN序列24h、48h的抑制率分别是70%、78%,柏较于siRNANc组及lipofectamine2000组ATM蛋白表达明显下降;而72小时后其蛋白
7、表达逐渐上升。2、ATM基因表达沉默后对肝癌细胞生物学特性的影响。选取高效抑$1JATM的siRNA片段转染肝癌细胞24h后,收集细胞,MTT法检测转染HepG2ATM、HepG2Nc组]及:lipofectamine2000=组细胞之间其增殖无明显差异(P>O.05)。转染24h后,给予X线照射,流式细胞仪检测结果显示:在未照射前,3组细胞的各期百分比未见区别,但占砂X线照射244,时后出现明显变化:V中文摘要正常HepG2细胞、HepG2Nc组细胞均形成G1、G2峰。而HepG2ATM组G:/M期细胞明显增多,S
8、期细胞所占百分比从31.8%降至11.1%(P<0.05)。细胞凋亡检测:通过AnnexinV—FITC/PI双染流式分析发现,各组细胞在未照射时无明显异常,占锣X线照射24d、时后发现正常HepG2细胞、HepG2Nc组细胞之间无明显变化(P>0.05),但HepG2ATM组早期凋亡细胞的百分比是HepG2Nc组的2倍(P<0.05)。彗星实
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