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1、活性跟踪法探究地骨皮中抑制NF-kB化学成分［摘要］传统中药地骨皮常用于治疗许多与炎症相关的疾病。该研究目的是确定地骨皮中抑制核转录因子NF-kB（炎症关键调控子）的活性成分。对不同溶剂的地骨皮提取物进行体外抑制NF-kB的活性试验，结果发现乙酸乙酯提取物与甲醇提取物表现出较强的抑制活性。通过活性跟踪分离纯化，获得4种酚酰胺类化合物，分别为：反-对羟基肉桂酰酪胺（1）、反-阿魏酰酪胺（2）、反-咖啡酰酪胺（3）与二氢咖啡酰酪胺（4）o它们对肿瘤坏死因子（TNF-a）诱导的NF-kB活性的抑制率差异非常显著，抑制率大小为3〉4>2~1。推
2、测反-咖啡酰酪胺为关键活性成分，其IC50为18.41nmol-L-lo通过构效关系分析说明，反-咖啡酰酪胺C-3位的餐基可能是与NF-KB结合的高亲合位点，而且C-7,8位双键介导了苯环、疑基的n电子共辄作用，从而形成独特的平面空间构型，有助于抗炎分子与靶标蛋白的空间契合。由此推断，含有a,不饱和酮及苯环的迈克尔受体结构与邻二酚嶷基共同决定了化合物3的生物活性。［关键词］地骨皮；核转录因子kB；活性跟踪分离；酚酰胺类；构效关系炎症是人们熟知的病理现象，近几年研究表明炎症也参与了癌症［1］、心血管疾病［2］及2型糖尿病［3］的形成。核转
3、录因子(NF-kB)广泛存在于多种组织细胞中，对细胞信号转导及基因表达调控起重要作用，是炎症启动、调节的关键核因子。NF-kB-般驻留在细胞质中，但被肿瘤坏死因子(TNF-a)或其他氧化应激等因素激活时，就会转移到细胞核中与DNA结合，导致促炎靶标基因的快速转录［4-6］。因此，以NF-kB为靶标筛选其抑制剂，有望获得预防与治疗炎症的高效药物分子。靶标筛选是一种新药筛选研究的模式，另一种是以生理学与表型为基础的筛选模式，2种模式相互补充和印证。当今以靶标为切入点的研究占主导地位，研发出了不少新药［7］。地骨皮LyciiCortex为茄科
4、植物枸杞LyciumchinenseM订1.或宁夏枸杞L.barbarumL.的根皮。主要分布在宁夏、甘肃、青海、新疆等北方省份，南方也有少量引种。地骨皮性味甘寒，归肺、肝、肾经，主要功效为凉血除蒸、清肺降火，一般常用于清虚热，泻肺火，凉血。主治阴虚劳热，骨蒸盗汗，小儿疳积发热，肺热喘咳，吐血，蠅血，尿血，消渴等［8］。现代药理学研究也表明，地骨皮具有镇痛［9］、降血糖［10-12］、降血压［13］、降血脂［14］、抑菌消炎［15］、改善胰岛素抵抗［16］等作用［17］。本研究以NF-kB为靶标,采用活性跟踪方法从地骨皮中筛选活性成分，
5、获得了一系列酚酰胺类化合物，并对其构效关系进行了初步探讨。1材料与方法1.1材料地骨皮购自湖南松龄堂中药有限公司，经湖南中医药大学药学院生药学教研室刘塔斯教授鉴定为甘肃枸杞L.chinense的根皮。小牛胎血清(FBS)与Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)购自瑞士巴塞尔Lonza公司；含NF-kB易感荧光素酶的HEK293细胞(RC0014)购自Panomics公司；NF-kB抑制剂阳性对照小白菊内酯(parthenolide),二甲亚矶(DMSO),葡聚糖凝胶(SephadexLH-20)来自Sigma-Aldrich
6、公司(北京)；编码绿色荧光蛋白的质粒(pEGFP-N1)购自美国Clontech公司；柱色谱硅胶(100〜300目)，薄层色谱硅胶板GF254来自青岛海洋化工二厂；其他试剂购自长沙汇弘试剂公司，用于柱色谱的有机试剂在使用前均进行重蒸、干燥处理。1.2生物活性跟踪分离地骨皮样品于50°C干燥48h后，粉碎至0.5〜1mm粒径大小。将50g地骨皮粉末置于500mL无水乙醇中，在搅拌下冷浸提取3次，每次8h,过滤，合并提取液，40T减压浓缩至干备用，此为地骨皮的总提取物(TE,2.3g),用于活性试验。对于活性跟踪分离，将5廊地骨皮粉末置于2
7、0L石油(60-90°C沸程)中，在搅拌下冷浸提取3次，每次8h,过滤，合并提取液，40£减压浓缩至干，得石油瞇提取物;过滤后的地骨皮残渣于通风橱中完全风干，按以上步骤依次用20L二氯甲烷、20L乙酸乙酯、20L甲醇与10L水进行3次冷浸提取，实现按化合物极性初步分离，共获得石油瞇提取物(PE,7.2g),二氯甲烷提取物(DE,83.7g)、乙酸乙酯提取物(EE，6.6g).甲醇提取物(ME，21.4g)及水提物(WE,100.4g)oNF-kB抑制活性结果表明,乙酸乙酯提取物与甲醇提取物表现出较强的NF-kB抑制活性，所以仅对这2个部
8、位进行活性跟踪分离纯化。取乙酸乙酯提取物2.7g,经硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇98:2〜40:60)梯度洗脱得到8个流分E1〜E8,其中E3(841mg)表现出较强NF-kB抑制活性。E3经硅胶柱色谱(乙酸
