apom通过抑制nfκb活性下调tnfα诱导的icam1和vcam1表达

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1、优秀毕业论文硕士学位论文目的1)．观察TNF—a对HepG2细胞中ICAM-1，VCAM-1，apoM及Ir．Ba表达的影2)．观察在HepG2细胞中，apoM对ICAM-l，VCAM-l以及Ird30t表达的影响；3)．观察在TNF—Q处理的HepG2细胞中，apoM对ICAM-1和VCAM·l表达的影响是否通过调节NF．r,B活性而实现。材料和方法1．主要材料TNF．0【购自美国Sigma公司；实时荧光定量PCR检测试剂盒(SYBR@PremixExTaqTMIIkit)和RNA逆转录试剂盒(PrimeScript@R

2、TReagentkit)均购自日本TaKaRa公司；TRIzol和Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。2．细胞培养人肝癌细胞系HepG2细胞购自美国ATCC；HepG2细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素／链霉素的DMEM完全培养基中，将细胞置于37。C、5％C02饱和湿度环境中培养。3．RNA提取、逆转录和实时荧光定量PCR根据RNA提取试剂盒操作说明书用TRIzoi(Invitrogen)等试剂提取培养细胞中的总RNA。然后将总RNA用逆转录试剂盒(TaKaRa)反转录成c

3、DNA。在ABI7500FAST荧光定量PCR系统上，按照实时荧光定量PCR反应程序进行扩增。每个样本同时设置3个复孔，实验重复3次，所得数据以人GAPDH基因作为内参进行相对定量分析。反应达到设定阈值时的扩增循环数设为Ct，按照AACt方法计算目的基因mRNA的相对表达变化。4．WesternBlot分析根据总蛋白提取试剂盒说明书提取HepG2细胞的总蛋白，采用Bradford法III精品参考文献资料优秀毕业论文万方数据精品参考文献资料优秀毕业论文中文摘要进行蛋白定量，以每个上样孔按照3099计算上样体积。然后在制备的S

4、DS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，孵育一抗抗体：anti．p．actin，anti．apoM，anti．ICAM．1，anti．VCAM．1和anti．IrBa抗体(Abcam)，4。C孵育过夜，孵育后用辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗兔lgG二抗抗体孵育，最后采用增强化学显色方法(ECL)进行曝光显影。5．siRNA．apoM转染apoM特异性小干扰片段(siRNA-apoM)购自广州锐博生物科技有限公司。转染前一天，将HepG2细胞按照适量细胞数接种到含有10％胎牛血清的DMEM培养基的6孔板中，以次日细胞达30％．50％

5、密度为宜。采用59L脂质体Lip02000转染培养细胞。置于37。C、5％C02、饱和湿度的环境中培养48小时后，采用WesternBlot技术检测目的基因蛋白表达情况。6．慢病毒载体转染构建带有GFP的慢病毒过表达载体LV-Mock和LV-apoM。将HepG2细胞按照适量细胞数接种到含有10％胎牛血清的DMEM培养基的6孑L板中，以次日细胞达30％．50％密度为宜。置于37"C、5％C02、饱和湿度的培养箱中培养过夜。次日，以慢病毒感染HepG2细胞病毒感染指数fMOI)为20进行转染，将41aLPolybrene(8

6、mg／mL)与稀释好的病毒液同时加入细胞中，轻轻摇匀，然后置于37。C、5％C02、饱和湿度的培养箱。转染6．24小时更换新的培养基，转染后96小时收集细胞检测目的基因蛋白水平的表达。7．NF．r,B活性检测在siRNA．apoM和TNF一伍处理HepG2细胞后提取细胞核蛋白，对提取的蛋白采用Bradford法进行蛋白定量。将样本加入到孵育有双链DNA(double．strandedDNA，dsDNA)生物素的ELISA板，在酶标仪450nm波长处读取光密度值。根据标准曲线，计算NF．rd3的含量。8．统计方法所有实验均独

7、立重复3次，数据以x+s表示，独立样本比较采用，检验，各IV精品参考文献资料优秀毕业论文万方数据精品参考文献资料优秀毕业论文硕士学位论文组间均数比较采用单因素方差分析，以SPSS13．0统计软件完成，P<0．05为差异有统计学意义。结果1．TNF一位下调HepG2细胞apoM及IKBa表达，上调ICAM一1和VCAM-1表达TNF．et是一种重要的炎性介质，首先我们观察了TNF．et对HepG2细胞中apoM，It,Bet，ICAM-l和VCAM一1表达的影响，我们以0ng／mL和10ng／mL的TNF．cL分别处理Hep

8、G2细胞，采用RT-PCR和WesternBlot技术检测各组细胞中apoM，IKBet，ICAM．1和VCAM．1的mRNA和蛋白表达情况。结果显示，TNF．Ⅸ处理组HepG2细胞中apoMmRNA和蛋白表达水平以及It,Bet蛋白表达水平显著下调，而ICAM．1和VCAM．1mRNA和蛋白表达水平显