水稻osdcl3b基因组织表达研究及沉默载体构建

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1、水稻OsDCL3b基因组织表达研究及沉默载体构建摘要：采用荧光定量PCR方法分析了釉稻93—11根、茎、叶和花药中0sDCL3b基因的表达，发现水稻不同组织0sDCL3b的表达量存在明显差异，花药中表达量最多，根中表达量最少。重点构建了水稻0sDCL3b基因的沉默载体，通过农杆菌介导转化粳稻中花11,获得了转基因T0代阳性植株，为进一步研究0sDCL3b基因的功能打下了基础。关键词：0sDCL3b基因；组织表达；载体构建；基因沉默；水稻中图分类号：Q943.2文献标识码：A文章编号:0439-8114(201

2、2)24-5788-03Dicer或Dicer—1ike(DCL)蛋白通过产生siRNA(si1encingRNA［和口匚RNA(microRNA)等小分子非编码RNAs(non—codingRNAs,ncRNAs)［1］来调控其他相关基因的表达，进而影响真核生物的生长发育、抗病抗虫性和逆境适应性等［2—4］。在水稻中，已报道至少存在8个可能的DCL蛋白基因［5］o最初，Liu等［6,7］对OsDCLl和OsDCL4进行了功能分析，发现OsDCL1与miRNA的生物形成密切相关，缺失0sDCL1的生物个体在幼

3、苗期出现发育停滞现象，如植株矮化、叶片卷曲、根扭曲等现象。OsDCL4主要影响大小为21nt的siRNA的生物形成，与拟南芥同源基因AtDCL4不同的是，沉默或缺失OsDCL4既影响生物个体的营养生长，又影响生物个体的生殖生长，而AtDCL4仅影响生物个体的营养生长。随后，Urayama等［8］的研究表明，敲除0sDCL2的转基因植株中内源性dsRNA病毒的含量水平将明显降低，植株表现为矮化和育性降低等。Wu等［9］证实，OsDCL3a与lmiRNA(1ongmicroRNA)的产生密切相关。最近，Song等

4、［10］进一步报道了OsDCL4、OsDCL3b和OsDCL1的功能；其中0sDCL3b的功能为首次报道，报道中仅指出了OsDCL3b的直接生物学功能是加工产生大小为24nt的小RNA,但这些小RNA究竟调控哪些相关功能基因的表达，以及相关功能基因的表达变化又如何影响转基因植株的生长发育、抗病抗虫性或逆境适应性等尚未见报道。基于在籾稻93—11花药中获得的0sDCL3b的全长cDNA序列(GenBank登录号：DQ208406),采用荧光定量PCR方法研究了籾稻93-11不同组织部位0sDCL3b基因的表达差

5、异，并利用RNA干扰技术构建了OsDCL3b基因的沉默载体，采用农杆菌介导法转化粳稻中花11,获得了转基因T0代阳性植株，为进一步研究OsDCL3b基因加工产生的各种小分子ncRNA究竟调控了哪些相关基因的表达、进而影响转基因植株的生长发育、抗病抗虫性或逆境适应性等打下了重要的基础。1材料与方法1.1材料1.1.1植物材料、菌种与质粒釉稻93—11和遗传转化所用材料粳稻中花11种子均由南昌大学生命科学与食品工程学院植物遗传研究室保存。用于基因沉默的质粒pYL为改造的RNAi-Ubi[11],由华南农业大学刘耀

6、光教授惠赠。大肠杆菌TopiOF'、农杆菌EHA105由南昌大学生命科学与食品工程学院植物遗传研究室保存。1.1.2主要试剂DL2000DNAMarker、PCR反应所用DNA聚合酶购自天根生化科技（北京）有限公司，质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，植物RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自Invitrogen公司，T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHI、HindIII、M1uI和PstI购自Fermentas公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合

7、成。1・2方法1・2.1总RNA的提取和正向干涉片段的RT-PCR扩增按Invitrogen公司的TRIzo1试剂盒提取粕稻93-11花药的总RNA后，将其反转录成cDNA,再用引物0sDCL3b-Si：5’-AATTGGATCCTCTAGACTCGAGGGTAAAGG-3z和OsDCL3b—Xi：5’一CCGGAAG2结果与分析2・10sDCL3b在粕稻93-11根、茎、叶和花药中的表达结果2.2沉默载体的构建结果2.3转基因T0代阳性植株的鉴定结果3讨论前人的研究结果表明，粳稻0sDCL3b在营养组织中往

8、往低水平表达，在花器官和种子发育初期则高水平表达[5]□本研究结果进一步显示，籾稻OsDCL3b基因在粘稻93-11的花药中表达量最高，在其他组织中表达量均较低，尤其是在根中的表达量几乎只有花药中的50%。由此推测，OsDCL3b基因在水稻花药中高水平表达可能是水稻穗子的生长发育所必需的，但有待于进一步试验证实。最近，Song等［10］首次报道了OsDCL3b的直接生物学功能是加工产生24nt的小R