应用非衍生化液相串联质谱法筛查遗传代谢病高危患儿380例初步研究

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1、应用非衍生化液相串联质谱法筛查遗传代谢病高危患儿380例初步研究【摘要】目的应用液相串联质谱(tandemmassspectrometry,MS/MS)技术对380例遗传代谢病(IEM)高危儿童进行筛查，初步了解我国IEM的发病种类和阳性率，为其有效防治提供科学依据。方法采集380例临床疑似遗传性代谢病高危儿童滤纸血片，用非衍生化法进行前处理后，采用安捷伦6460串联质谱仪分析其氨基酸和酰基肉碱浓度。结果发现阳性患儿31例，其中氨基酸代谢病18例(58.1%),脂肪酸代谢疾病8例(25.8%),有机酸血症5例(

2、16.1%)0结论液相串联质谱可以快速检测血滤纸片中的氨基酸及酰基肉碱浓度，是筛查IEM的有效工具。【关键词】非衍生化液相；串联质谱法；遗传代谢病遗传性代谢病或先天性代谢缺陷病(inbornerrorsofmetabolism,IEM)是参与体内代谢的某种酶、运载蛋白、膜或受体等编码基因发生突变，使其编码产物功能不良而引发代谢失常的一类疾病［1］。它多为单基因遗传病，由ArchibaldE.Garrod最先提出这一概念，包括代谢大分子类疾病：溶酶体贮积症、线粒体病等和代谢小分子类疾病：氨基酸、有机酸、脂肪酸等。

3、国外已经开始全面普及遗传代谢病筛查，发达国家从上世纪90年代开始大面积普及液相串联质谱技术用于新生儿筛查，应用该技术可以通过一次实验同时检测氨基酸、有机酸及脂肪酸等多种疾病［2］。本研究利用非衍生化串联质谱(tandemmassspectrometry,MS/MS)法对380例疑似遗传性代谢病高危儿童进行检测，了解遗传代谢病的阳性率，为我国新生儿筛查项目的扩展提供参考。1资料与方法1.1研究对象2012年6月至2013年9月河南省郑州市儿童医院就诊的临床疑似先天性遗传代谢性疾病高危患儿380例，其中男176例，

4、女204例。年龄为生后20h至8岁，其中新生儿期146例，婴儿期150例，幼儿期40例，儿童期44例。1.2标本收集与保存使用一次性采血针刺足跟或手指，深度小于3mm,将血滴于ScheicherandSchuell903滤纸样本卡，血斑正反面一致，室温下自然晾干呈深褐色，放于封口塑料袋内，保存于2-8°C冰箱中待检。1.3试剂和仪器甲醇、乙睛、甲酸胺、甲酸均为高效液相色谱级别，购自Sigma公司。96孔聚丙烯锥形板，96孔过滤板，同位素内标及质控购自PE公司。氨基酸内标11种:2H4-丙氨酸，2H4,13C-精

5、氨酸，2H2-瓜氨酸，15N,2-13C-甘氨酸，2H3-亮氨酸，2H3-蛋氨酸，2H6-鸟氨酸，13C6-苯丙氨酸，13C5-脯氨酸，13C6-酪氨酸，2H8-纟颉氨酸。酰基肉碱内标13种：2H9-游离肉碱，2H3-乙酰肉碱，2H3-丙酰肉碱,2H3-丁酰肉碱，2H9-异戊酰肉碱，2H6-戊二酰肉碱，2H3-己酰肉碱，2H3-辛酰肉碱，2H3-癸酰肉碱，2H3-十二酰肉碱,2H3-十四酰肉碱，2H3-十六酰肉碱，2H3-十八酰肉碱。上述内标在实验前用甲醇稀释成工作液备用。仪器：美国安捷仑公司高效液相色谱仪(A

6、gilent1600)及6460TripleQuadLC/MS型串联质谱仪。1.4测定方法用打孔器将滤纸片打出直径3mm的圆形滤纸血片，置于96孔过滤板中，每次实验加入高低两个质控及一个空白，每孔加入工作液100uL,以封板膜密封，放置于恒温震荡仪以700转/分震荡45min,然后提取75»L上清液加入另一个96孔聚丙烯锥形板中，铝箔包裹，即上样检测。1.5仪器设置高效液相色谱仪的流动相采用乙睛和纯水，自动进样器每次进样2uL,每次测定采用多反应监测方式进行检测。一个样品测试约需7min。1.6数据分析质谱原始

7、数据的定量分析采用自带软件MassHunterB.05.00进行分析，根据氨基酸和酰基肉碱同位素内标的离子峰强度，计算出所测样品中氨基酸和酰基肉碱的浓度，并同时计算出比值。2结果检测380份临床疑似遗传性代谢病高危儿童血片，诊断遗传代谢病9种31例，检出率为8.2%O31例患儿中氨基酸代谢病18例（58.1%）,有机酸血症5例（16.1%）,脂肪酸代谢疾病8例（25.8%）o其中氨基酸代谢病18例分别为苯丙酮尿症（PKU）8例，枫糖尿病（MUSD）3例，高甲硫氨酸血症4例，同型胱氨酸尿症1例，精氨酸血症2例；有

8、机酸血症5例分别为：甲基丙二酸血症（MMA）或丙酸血症（PA）4例，中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（MCAD）1例；脂肪酸代谢疾病8例包括肉碱转运障碍（CTD）6例和异戊酸血症（I）2例。3讨论先天代谢缺陷病（IEM）多在儿童时期发病，以新生儿期和婴幼儿期多见，我们的研究中新生儿期和婴儿期患儿共有336例，占据了所研究患儿的绝大多数，也说明了这一点。遗传性代谢病病种繁多，目前已发现近100