组织快法分离、培养鼠牙胚间充质细胞

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1、组织快法分离、培养鼠牙胚间充质细胞俟景秋1闫雪丹1樊开斌2刘昱新2张慧颖2闫征斌1,2（1大庆油ffl总医院黑龙江大庆163001;2佳木斯大学口腔医院黑龙江佳木斯154002）【中图分类号】R-332【文献标识码］A【文章编号】1672-5085（2013）22-0113-02【摘要】目的采用组织块法从小鼠胎鼠的牙胚组织分离培养间充质细胞，鉴定其细胞特性。结论成功培养小鼠胎鼠牙胚间充质干细胞，体外稳定传代6代以上，有成为组织工程种子细胞的应用前景。【关键词】牙胚间充质细胞细胞培养从小鼠胎鼠下颌第一磨牙牙胚中分离外胚间充质细胞，组织块法培养,鉴定其外胚

2、间充质干细胞特性和分泌形成基质蛋白能力，旨在为下一步在牙组织工程中的应用奠定基础。1材料和方法1.1材料DMEM/F12培养基（D/F12）、胎牛血清（FBS）、白血病抑制因子（LIF）、鼠抗CD57/HNK-1单抗、鼠抗波形丝蛋白单抗、鼠抗I型胶原单抗，FITC荧光标记羊抗鼠IgG二抗。1.2方法1.2.1取材与培养1.2.1.1机械法分离胎鼠牙胚间充质六周龄Balb/c小鼠雌雄同笼，第2日晨查见阴道栓后，计为胎鼠零时,中午12：00为0.5日胎龄。取15.5日胎龄孕鼠，断颈处死，75%酒精浸泡5min,剖腹取出子宫，75%酒精浸泡5min,剖子宫壁

3、和羊膜囊，体视显微镜下，分离下颌突，机械剥离牙胚上皮，从牙胚陷窝中剥离下颌第一磨牙牙胚间充质。1.2.1.2细胞培养方法组织块法培养直接以0.5—的牙胚间充质组织块均匀接种至培养瓶内，组织块间隔<lcmo37.5°C、5%CO2、饱和湿度条件下培养l・5h后再加适量培养液培养，2—4天换液一次。细胞传代当细胞长满瓶底80%吋，弃培养液，37.5°C以2.5g/L胰蛋白酶消化3min,培养液中和并吹打均匀，细胞计数，调整为5×105/ml浓度后43传代。1.3观测指标13.1倒置显微镜观察细胞形态原代细胞贴壁后,每天在倒置显微镜下观察细

4、胞形态，记录生长状况。1.3.2记录生长曲线并计算细胞倍增吋间1.3.3免疫组化鉴定细胞表面标志1・3・4端粒酶活力测定2结果2.1细胞生长和形态观察组织块接种后，3-5天组织块周围可见细胞放射状游出，12-15天可长满瓶底80%,细胞呈梭形和多角形，但梭形较多，胞体丰满，单细胞核细胞居多。传代后细胞多角形态者增加。2.2生长曲线与细胞倍增吋间细胞生长曲线呈“S”形，第3〜5d细胞处于增殖期。经计算，组织块法细胞倍增时间为2.19±0.23do2.3细胞表面标志鉴定免疫细胞化学染色见培养细胞CD57/HNK-1.波形丝蛋白表达阳性，均为胞

5、浆着色。2.4端粒酶活力测定端粒酶原位杂交显示部分细胞表达较高端粒酶活性，图像分析计数计算第3代细胞端粒酶表达比例为42.3±12.4%o3讨论牙胚的器官发育，始于颅神经悄来源的外胚间充质细胞和原始口腔上皮细胞的相互作用。本实验旨在探讨分离培养牙胚组织中外胚间充质细胞的可行途径，并初步鉴定细胞表面特性，了解体外单层细胞培养条件下细胞的生物学特点。单纯胰蛋白酶消化牙胚，往往对牙胚细胞造成伤害。实验中组织块法第3代细胞纯度均可达到95%以上，说明采用机械法分离较为彻底，可以基本去除上皮和下颌突间充质的干扰，能满足对牙胚间充质干细胞进-步研究的

6、需要。单克隆抗体CD57/HNK-1属于CD57抗体簇，是神经外胚间充质细胞的标志物，同时也表达于自然杀伤淋巴细胞和多型神经内分泌细胞表面。本研究中,上述两种抗体染色均为阳性，表明所培养细胞为神经悄来源外胚间充质细胞。端粒酶是一种能够催化延长端粒末端的核糖核蛋白，在生殖细胞、干细胞和肿瘤细胞中高度表达，是这些细胞能够不断分裂增殖的主要原因。本实验中,第3代细胞端粒酶表达比例在42.3%,明显高于正常组织中表达量，说明培养细胞中有较大量干细胞成分。本研究结果表明，采用机械法分离15.5日胎龄小鼠胎鼠下颌第一磨牙牙胚间充质，组织块法培养，可以获得高纯度牙胚

7、间充质干细胞。牙胚间充质干细胞为梭形或多角形，增殖能力活跃，均一性表达外胚间充质干细胞表面标志CD57/HNK-1,同时表达波形蛋白，具有较高的端粒酶活性，原代培养形状稳定，有作为牙组织工程种子细胞的应用前景。参考文献[1]LiuW,CuiL,CaoY.AcloserviewoftissueengineeringinChina:theexperieneeoftissueconstructioninimmunocompetentanimals.TissueEng.2003,9(Suppll):S17-30・[2]ChaiSlavkinHC・Prospe

8、ctsfortoothregenerationinthe21stcentury:aperspe