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1、维生素D受体基因多态性和慢性乙型肝炎患者关联探究【摘要】目的：探讨维生素D受体（VDR）FokI基因多态性与慢性乙型肝炎患者临床表型的关联。方法：应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）技术检测VDRFokI基因的多态性在44例慢性乙型肝炎重度患者、46例中度患者和40例非活动性HBsAg携带者中的分布,并进行基因型分析。结果：慢性乙型肝炎重度组、慢性乙型肝炎中度组VDRFokI基因的基因型与对照组（非活动性HBsAg携带者）比较差异有统计学意义（P0.05）,具有可比性。1.2方法1.2.1实验室检查肝功能相关指标，包括A
2、ST/ALT.血清总胆红素TBIL.凝血酶原活动度PTA、血清白蛋白；检测HBsAg、anti-HBs.HBeAg、anti-HBe和anti-HBc及HBV-DNA滴度。1.2.2基因组DNA的提取留取慢性乙型肝炎中度及重度患者和非活动性HBsAg携带者空腹12h后，晨起静脉采血4mL（EDTA抗凝），采用硅胶柱纯化方式，用血液DNA提取试剂盒（D3741-01美国OMEGA）,从700?L抗凝血液中提取淋巴细胞基因组DNAo利用UV计测定所提取的DNA浓度及纯度，并将其稀释至10ng/?L,分装保存于-20°C冰箱保存备用。1.2.3聚合酶链
3、反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)VDRFokI基因的引物序列：上游引物，5,-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3；下游引物，5,-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3o总反应体系均为25uL：1?L基因组DNA,2.5?L10XPCR缓冲液，上下游引物各0.5uL,dNTPs2?L,0.25?LTaqDNA聚合酶，去离子水18.25?LoVDRFokIPCR扩增条件：95°C预变性4min；98工变性10s,63退火30s,72°C延伸60s,共30个循环；72°C再延伸5mino取
4、扩增的PCR产物0.5?L,1?L限制性内切酶FokI,及2?L10XMBuffer,2?L0.1%BSA(由大连TaKaRa公司提供)及14.5?L灭菌水组成酶切总反应体系20?L,置于37°C水浴1h,进行FokI酶切，将酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳，以DL700Marker为参考，紫外凝胶成像仪下观察结果。1.3观察指标比较慢性乙型肝炎现症患者重度组、中度组和对照组VDR基因多态性的差异；VDRFokI基因多态性与慢性乙型肝炎不同病情程度的关联程度。1.4统计学处理分别统计CHB现症患者重度组、CHB现症患者中度组和对照组非活动性HBsAg
5、携带者基因型和等位基因的分布频率数据，用SPSS13.0统计软件分析，Hardy-Weinberg遗传平衡检验，P>0.05认为资料可靠，代表性好。计数资料采用字2检验，以P3讨论VDR基因定位于12号染色体长臂，其包含有11个外显子，在基因组上总长为75Kb,VDR包含427个氨基酸残基,分子量为50KD[4]o目前报导的VDR基因多态性与4个单核昔酸多态性位点有关，分别为2号外显子的FokI位点、第8内含子的BsmI位点、ApaI位点及第9外显子的TapI位点。近年来，人们逐渐认识到VDR的基因多态性除了参与调节钙磷代谢外，其有着更广泛的生理
6、作用，女口：抗增殖、抗分化、调节细胞凋亡、介导免疫反应及多种内分泌腺激素的分泌，调节造血组织造血等作用[5-6]o研究证明，Treg细胞和Thl7细胞这两种细胞亚型参与了免疫介导性肝炎的发病机制。Treg细胞为体内致免疫耐受的主要细胞，其有效控制病原体的T细胞反应，而Thl7细胞主要通过产生细胞因子，如IL-17可促进炎症反应，这两种细胞亚型在特定的某些细胞因子等因素的作用下，可相互转换，相互制约[7-9]oSneha等[10]研究发现1,25-(0H)2D3可以通过阻碍IL-17转录因子活化T细胞核因子(NF-AT)复合体的形成，从而抑制IL-
7、17的分泌，进而减轻Thl7细胞介导的促炎症反应。另有研究表明，1,25-(OH)2D3及其类似物通过作用于树突状细胞的nVDR,抑制了树突状细胞的成熟，使其处于未成熟状态，因此其不能激活初始T细胞,进而使免疫反应不能继续[11-12]o目前认为，不成熟树突状细胞可分泌TGF-b和/或IL-10来诱导初始T细胞向Treg细胞转化，增加Treg细胞的水平，提高了机体的免疫耐受性[13-14]o本实验结果显示，CHB重度组、中度组患者的f等位基因分布频率高于对照组，提示等位基因f分布频率的提高可能与CHB的炎症再活动存在一定的关系。有研究表明，VDR
8、基因FokI多态性的C-T替换(F等位基因-f等位基因)，造成潜在的起始位点，f等位基因编码的VDR增加了3个氨基酸，f等位基因的转录效
