pde4在博莱霉素诱导的小鼠炎症及肺纤维化过程中的表达与作用研究

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1、浙江大学硕士学位论文PDE4在博莱霉素诱导的小鼠炎症及肺纤维化过程中的表达与作用研究姓名：李金优申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：汤慧芳20120115浙江人学硕I：学位论文中义摘要PDE4在博莱霉素诱导的小鼠肺炎症及纤维化中的表达与作用研究项目受国家基金面上项目资助(NO：30800497，81170536)浙江大学医学院药理学系硕士研究生李金优导师汤慧芳副教授摘要目的：观察博莱霉素诱导的小鼠肺损伤过程中磷酸二酯酶4亚型的mRNA与蛋白质的表达随时间的变化，初步探究PDE4在小鼠肺炎症及纤维化过程中的作用。方法：采用

2、8周龄c57BL／6雄鼠进行博菜霉素肺纤维化造模，给药方式为有创气道滴入法，给药剂量为2．5mg／l(g，在给药后第3日、7日、14日、21日和28日处死小鼠采集样本。利用细胞形态学方法计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞的总数及分类计数；应用髓过氧化物酶(MPo)活性测定试剂盒测定组织匀浆液中MPO活性；应用可溶性胶原测定试剂盒测定组织匀浆中可溶性胶原的含量。利用ELIsA法测定BALF中MIP．2、IL．6、IL．1p、TNF．0L和TGF．p1的含量。采用荧光定量real．timePcR方法检测博菜霉素刺激后各时期

3、小鼠肺组织中PDE4各亚型的mIⅢA表达量；westemblot测定PDE4各亚型的蛋白表达量，利用免疫组织化学法检测PDE4各亚型蛋白的表达与分布；结果：(1)病理变化：病理切片masson染色结果显示博莱霉素刺激后胶原逐渐沉积、肺纤维化逐渐形成的过程。对照组的肺组织肺泡完整且结构清晰。而在纤维化早期的7天内主要表现为炎症细胞的浸润，气道上皮细胞排列不规则并脱落；肺泡结构少量破坏。在第14天开始胶原逐渐形成并沉积于气道附近的病灶区，在纤维化后期，胶原大量沉积，气道重塑，肺泡组织被严重破坏，间隔消失形H浙江人学硕l：学位论义

4、中文摘要成空洞。(2)BALF中的白细胞总数及分类计数变化：博莱霉素刺激后第3日白细胞总数及中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数目分别达到最大值75．19士3．89(×105cell／mL)，之后逐渐有所减少，在第21天后大幅回落，但相对于空白组3．14士O．69(×105cell／mL)有显著性差异，(尸<0．01)。博莱霉素刺激分泌到气道中的炎症细胞主要以巨噬细胞为主，在刺激后第3日，巨噬细胞占白细胞总数的51．23％。(3)BALF中细胞因子的变化：博莱霉素刺激后引发炎症因子大量分泌。IL．1p在博莱霉素刺激的第3日达到最

5、高值218士69pg／ml(氏O．001坩空白组)；14日后之后逐渐回落接近正常范围。IL-6也是在第3日达到峰值405士119p∥ml(P<0．001坩空白组)。而MIP．2则随着时间延长而分泌量逐渐增加，第28日的分泌量是空白组的324％，达133士41p∥ml(氏0．01w空白组)；TGF-pl与TNF-0【的分泌量在第7日达峰值，TGF—p1为390生57p∥ml(氏0．001坩空白组)，TNF．0【为450士57p∥ml(氏0．001vs空白组)，之后逐渐减弱。(4)肺组织中MPo及胶原的变化：测定结果显示肺组织中

6、胶原含量从第7日26．1士3．82(p∥mgtotalprotein)逐渐增高到第28日36．3士5．95(“∥mgtotalprotein)的过程，结果有显著差异，尸<0．01，胶原累积显示出肺纤维化程度逐渐加深。博莱霉素引发的炎症反应导致组织中MPO活性增加，在第14日达到峰值O．838士O．050(u11it／mgtotalprotein)。之后逐渐降低，显示出早期炎症反应逐渐消弱，肺组织上皮损伤介导启动过度修复，造成肺组织胶原沉积于间质，从而引发肺纤维化。(5)PDE4AmRNA、蛋白表达及分布的变化：PDE4AmR

7、NA在博莱霉素诱导的肺纤维化中期表达减少，第7日为最低点，表达量仅为正常值的18．9％(O．189±o．053)，氏0．002，纤维化过程被激活后逐渐恢复正常。总体走势呈V谷形，免疫组化结果显示PDE4A蛋白主要分布于炎症细胞胞浆，在博莱霉素刺激后第7日、14日表达较少，之后逐渐回归正常。(6)PDE4BmRNA、蛋白表达及分布的变化：根据real．timePcR结果，博莱霉素刺激后肺组织中PDE4B的mRNA表达量随时间的发展而呈显著的增加趋1IT浙江人学顾I：学位论义中文摘要势。在第14天后PDE4B的mRNA表达开始与

8、对照组有显著差别，相对表达量Ratio为1．67士0．57，(P<0．02w空白组)；第28天为最高值，与空白组相比，PDE4BmRNA的相对表达量Ratio为2．57士O．8l(P