骨癌痛模型大鼠的延髓头端腹内侧核团中的小胶质细胞和p2x7受体参与下行易化作用机制研究

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1、第二军医大学博士学位论文骨癌痛模型大鼠的延髓头端腹内侧核团中的小胶质细胞和P2X7受体参与下行易化作用机制研究姓名：黄章翔申请学位级别：博士专业：麻醉学指导教师：俞卫锋201205延髓头端腹内侧核团P2X7受体参与骨癌痛摘要肿瘤晚期影响病人的情绪和生活质量的重要问题之一就是疼痛。而且这可能成为病人及家属决定停止积极治疗的一个重要因素。因而研究癌痛的机制，解决癌痛之苦成为临床上的迫切需要。临床最常见的三大肿瘤为肺癌、乳腺癌、前列腺癌，此类肿瘤晚期很容易发生骨转移，而骨转移癌引起的疼痛是非常剧烈而难以控制的。因此从研究骨癌痛的发生发展机制入手揭开癌症

2、痛的机制有重要的临床意义。癌痛属慢性疼痛的范畴，与炎症痛、神经病理性痛相比，有独特而复杂的机制，因此许多常规的治疗手段效果较差。慢性疼痛状态可以引起中枢神经系统的可塑性改变，从而引起脑功能的长时程改变。近年来的许多研究表明，慢性疼痛可以导致大脑．延髓．脊髓的下行易化正反馈环路活动的持续放大，从而诱导慢性疼痛的加剧和维持。当持续的伤害性刺激存在时，下行易化系统的重要核团延髓头端腹内侧核团(RVM)神经元可发生神经可塑性改变，导致持续的疼痛易化。内源性痛觉下行调制系统激活，引起作为主要神经递质的5．HT在脊髓背角释放而发挥下行调节作用。骨癌痛同样是一

3、种恶性慢性痛，但在癌痛状态下，下行易化系统是否激活，及其作用机制却并不清楚。在神经病理性疼痛和炎性痛模型中，已有研究表明RVM中的胶质细胞激活参与下行易化系统的激活，抑制胶质细胞的功能可以抑制其痛行为。而外周和脊髓中的P2X7受体已被证明参与神经病理性疼痛和炎性疼痛，但至今没有RVM的胶质细胞和P2X7受体参与骨癌痛的维持机制的报道。根据预实验结果和有关文献，我们推测P2X7受体和胶质细胞可能参与骨癌痛引起的下行易化系统激活。为此，本研究在大鼠胫骨骨髓腔内接种Walker256乳腺癌细胞建立的骨癌痛模型上，应用免疫组织化学、免疫印迹分析、ELIS

4、A、荧光定量PCR及行为学等方法，对骨癌痛的发展过程中RVM的胶质细胞和P2X7受体在骨癌痛中枢下行易化系统中的可能作用机制进行了初步探索。主要结果如下：1．大鼠胫骨转移性骨癌痛模型的建立。将walker256细胞注入大鼠胫骨骨髓腔后第7天起可以引起显著而稳定的机械痛行为学表现，且可以引起对侧的镜像痛表现，骨癌痛大鼠模型的热行为学表现不稳定。在大鼠第14天和第2l天的X光片中可以看出肿瘤细胞可以引起骨质的破坏。在第14天时使用免疫组化的方法观察脊髓星形胶质细胞表达情况，可以看出骨癌痛大鼠脊髓星形胶质细胞显著激活，这些都与之前的骨癌痛模型报道一致。

5、2．RVM中胶质细胞和P2X7受体参与骨癌痛所引起的下行易化作用。第二军医大学博士论文大鼠骨癌痛模型成功建立后第7天和第14天的脊髓、RVM、PAG、ACC核团Fos阳性神经元表达较假手术组显著增加。这表明骨癌痛可以导致下行调制相关核团激活。本研究选择大鼠的RVM核团，使用westernblot和免疫组化的方法观察骨癌痛模型中胶质细胞和P2X7受体的表达情况。结果表明骨癌痛可以显著激活RVM中的小胶质细胞和星形胶质细胞，并且导致P2X7受体表达显著增加。抑制小胶质细胞的激活和P2X7受体功能可以抑制大鼠的骨癌痛行为。我们成功的使用RNA干扰的方法

6、抑制了RVM中的P2X7受体表达，可以观察到骨癌痛大鼠的机械痛敏得以减轻。同时，干扰了P2X7受体功能和表达后，可以抑制骨癌痛导致的RVM中的小胶质细胞和星形胶质细胞激活，可以抑制骨癌痛导致的RVM中的D型丝氨酸(D’serine)的表达增加，从而抑制RVM中的5-HT表达增加和脊髓中的Fos阳性细胞表达增加。这可能是骨癌痛下行易化激活的机制之一。3．下行易化系统激活脊髓5HT3受体参与介导骨癌痛形成使用ELISA的方法观察骨癌痛第14天大鼠模型脊髓的5．HT含量，结果表明骨癌痛大鼠模型脊髓的5．HT表达增加。在肿瘤第14天大鼠鞘内注射5HT3受

7、体拮抗剂(恩丹西酮)可以显著的抑制机械痛敏已达高峰期的大鼠机械痛行为和下行易化相关核团的神经元激活。使用荧光定量PCR的方法观察大鼠脊髓背角5-HT3受体mRNA表达，结果表明5-HT3受体mRNA表达并不显著增加，而因此，骨转移癌引起痛行为的原因可能并不是由于脊髓的5-HT3受体表达水平增加而是由于脊髓的5-HT含量的增加。综上所述，在接种Walker256大鼠乳腺癌细胞引起的大鼠胫骨转移性骨癌痛模型中，下行易化通路被显著激活，RVM中的胶质细胞和P2X7受体激活可能参与了骨癌痛的发生和维持。本研究提示，RVM中的胶质细胞和P2X7受体可能可以

8、作为新的治疗骨癌痛的靶点。关键词：骨癌痛；下行易化；P2X7受体；小胶质细胞；痛觉过敏延髓头端腹内侧核圆P2X7受体参与骨癌痛_一———