膜联蛋白a5影响系统性红斑狼疮血栓形成倾向的研究

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1、第三军医大学博士学位论文膜联蛋白A5影响系统性红斑狼疮血栓形成倾向的研究姓名：周迪申请学位级别：博士专业：皮肤病与性病学指导教师：郝飞201205第三军医大学博士学位论文膜联蛋白A5影响系统性红斑狼疮血栓形成倾向的研究摘要研究背景和目的：系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，SLE)是一种典型的自身免疫性疾病。随着SLE近期生存率提高，心脑血管事件发病率显著增加，已形成第二个死亡高峰。研究生本人在从事硕士课题研究阶段，运用了比较蛋白质组学的方法，鉴定并验证了在SLE患者的外

2、周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)中存在差异表达的16种蛋白质，并对这些蛋白质进行了相关的生物信息学分析。其中的膜联蛋白A5(annexinA5，AnxA5)在SLE患者中的高表达引起了我们的注意。AnxA5是膜联蛋白家族中少数具有抗凝活性的重要成员，但其在SLE发病中的确切机制目前尚无统一认识。如能明确它在SLE发病中的具体作用，对预防严重血管事件显然具有积极的意义。我们拟主要从SLE患者的临床表现及外周血中的AnxA5实际表达水平出发，明确An

3、xA5分子在SLE患者的外周血细胞中出现了表达差异，分析AnxA5的表达水平与SLE临床症候群的关联性。同时，筛查AnxA5及几种常见的抗磷脂抗体(anti—phospholipidantibody，aPL)在SLE患者血清中的表达水平，分析这些aPL分子相互之间以及与SLE不同临床表现的关联。最后我们通过外源性重组的AnxA5分子及anti．AnxA5单克隆抗体对SLE患者的数项临床凝血筛查实验进行干预，初步探讨AnxA5分子影响SLE患者血栓形成倾向的作用通路。方法：研究采集了200名女性SLE患者及

4、174名健康对照者的血液标本。1．通过二维电泳(2．DE)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)与免疫印迹(Westernblot)，验证SLE患者外周血单个核细胞中AnxA5的表达情况，并分析在胞浆、胞膜亚细胞组分中的表达差异。对显影条带进行半定量处理后，分析统计意义及与临床指标的相关性。。2．运用酶联免疫吸附实验(ELISA)，测定患者及健康对照者的血清AnxA5浓度，同时测定相关分子anti—AnxA5抗体、p2糖蛋白I(p2GPI)、抗氧化性磷脂(anti—Ox．PLs)和抗心磷脂抗体(aCLI

5、g：G)的水平，分析这些分子相互之间及其与各种临床表现的相关性。6第三军医大学博士学位论文3．重组AnxA5蛋白和anti．AnxA5单克隆抗体对SLE患者及健康对照的贫血小板血浆进行体外干预，运用自动化凝血分析仪检钡,tleb源性物质干预后，凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(Fib)和凝血酶时间(TT)等常规凝血筛查实验的结果变化。主要结果：1．Westernblot验证了AnxA5在jk多数SLE患者的PBMCs中存在高表达，半定量后的统计分析提示其变化有显著性意义(60

6、．7％VS．6．4％，P=0．0004)。2．SLE患者和健康对照者的PBMCs胞膜蛋白中，AnxA5无明显差异，而在胞浆蛋白中患者组的AnxA5高于健康对照组。3．经环磷酰胺(CTX)治疗后的SLE患者，其PBMCs中的AnxA5明显低于未经CTX治疗的SLE患者(17．0％vs．97．4％，P=O．014)，但与CTX累计量不具有剂量依赖关系。4．SLE患者血清中的AnxA5总体上明显低于健康对照者(26．84-3．0ng／mLvs．49．0士3．3ng／mL，P

7、近，甚至比对照者更高的SLE患者。5．血清AnxA5升高的SLE患者与血栓形成性疾病的发生有明显相关性(Mann—WhitneyZ=一2．084，P=O．037)。6．SLE患者血清中的AnxA5与anti—AnxA5、[32GPI、anti—Ox-PLs、aCLIgG均无统计相关性。7．Anti．AnxA5与血栓形成的相关性不完全明确，但受到血清anti．AnxA5极高值的影响较为明显(pearson’s(r)=O．340，P

8、8．外源性AnxA5及anti．AnxA5的干预都可以延长SLE患者的PT和APTT时间，以及缩短TT时间。9．外源性anti—AnxA5的干预可以提高SLE患者血清中功能性Fib的含量。10．外源性AnxA5干预健康对照的凝血筛查实验，结果的变化趋势与其干预SLE患者时相似，但后者的变化更为显著。结论：1．在SLE的发病过程中，外周血中的AnxA5具有在细胞内升高，在胞外血浆中降低的分布差异。这种分布特点可能发挥了某种保护作