牛传染性鼻气管炎抗体乳胶凝集检测方法的建立与应用

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1、华中农业大学硕士学位论文牛传染性鼻气管炎抗体乳胶凝集检测方法的建立与应用姓名：范强申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：刘正飞201206摘要牛传染性鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis，IBR)，是一种由牛疱疹病毒1型(BHV-1)三J}起家养或野生牛的传染病。主要分为呼吸道型和生殖道型，其临床症状主要表现为传染性鼻气管炎、结膜炎、以及传染性的脓性外阴道炎、睾丸炎、流产。该病在世界范围都广泛流行，阳性牛的检出和扑杀是控制该病最有效方法，但是对于出栏量大的一些发展

2、中国家无法做到这些，故采取免疫接种的方式预防本病。虽然有许多国家在进行控制措施，但是只有澳大利亚、丹麦、芬兰、瑞典、瑞士、挪威、意大利的波尔查诺省以及德国的上弗兰肯和上普法尔茨地区以及根除了该病。对于本病的检测，目前在国际贸易中OIE推荐的方法包括精液中病毒的分离、real—timePCR、病毒中和实验、酶联免疫吸附试验等。但是这些方法要不比较费时费力，或需要特定的仪器设备，同时要求检测人员具有一定的实验技能。所以本研究旨在研究一种快速简便可用于现场的检测方法。本研究利用蔗糖梯度离心，分离纯化出加工完整的

3、BHV-1病毒粒子，利用纯化的病毒粒子免疫小鼠，从而制备单克隆抗体。然后将其致敏空白乳胶，确定最佳的致敏和封闭条件。然后利用血清中和试验对建立的方法进行了敏感性实验，接着进行了特异性、重复性试验。最后运用建立的LAT方法检测了新疆、江苏、内蒙古地区的512份临床样品。主要包括如下几点工作：1．BHV-1单克隆抗体的制备(1)在MDBK细胞系上增殖扩大BI-IV-1病毒，利用超高速蔗糖梯度离心分离纯化病毒粒子，获得加工完整的病毒粒子。(2)利用纯化的病毒粒子，灭活后免疫BALB／c小鼠，经过融合、筛选、单克

4、隆化获得三株稳定分泌针对BHV-1的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。扩大后腹腔注射BALB／c制备腹水。2．牛传染性鼻气管炎LAT方法的建立(1)使用纯化病毒粒子致敏空白乳胶，并确定最佳致敏条件和封闭条件，制各乳胶诊断抗原；接着完成了特异性试验和重复性试验。(2)用LAT方法与血清中和试验方法同步检测新疆和内蒙古送检的252血清，总符合率为96。4％，两种方法检测结果具有很高的符合率，差异不显著(P>0．05)，从而建立了一种快速准确检测IBRV抗体的乳胶凝集方法。(3)用所建立的方法对来自内蒙古、新疆、江苏等

5、地区的512份临床随机样品进行检测。共检测出177份阳性血清，其阳性率为34．6％，这与其他实验室的检测结果也是基本一致的。总之，本研究成功制备BHV-I单克隆抗体，建立乳胶凝集快速诊断，为该病的防控提供了工具。关键词：牛传染性鼻气管炎；牛疱疹病毒1型；乳胶凝集试验；单克隆抗体华中农业大学2012届硕士学位论文--_l_●l●--_●__-_H-—_-__—-___●●_—-_-—●--_●__-—_-_—。--_●-_—__-’____●_____-—__-——_--●__—-__—-__—-__’—_

6、-_—_-——---_●一_-_—I__—-__—__-—●_____-__-_-●_一AbstractInfectiousBovineRhinotracheitis(IBR)iSadiseaseofcattleandbison．causedbybovineherpesvirustype1．IBRischaracterizedbyrespiratoryand／orgenitalmanifestation，Theclinicalsymptomsincludeinfectiousrhinotracheitis

7、，conjunctivitis，infectiouspurulentvaginitis，orehitisandabortion．Itiswidespreadintheworld，serologicaltestingandremovalofinfectedanimalsarebestmethodstocontrolthedisease．Atpresent，Austria,Sweden，Italy(provinceofBolzano)，Switzerland，Denmark，NorwayFinlandandp

8、artsofGermanv(the‘Oberfranken’and‘Oberpfalz’districtsofBavariahavesucessfullyeliminatedIBR．However,withrespecttothedevelopingcountries，eradicationwouldbedifficult，perhapsimpossible,andveryexpensive．Forthediagnostico