柑橘酸腐病菌的致病机理及其拮抗酵母的研究

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1、华中农业大学硕士学位论文柑橘酸腐病菌的致病机理及其拮抗酵母的研究姓名：王哲申请学位级别：硕士专业：果树学指导教师：龙超安201206柑橘酸腐病菌的致病机理及其拮抗酵母的研究摘要柑橘酸腐病菌Geotrichumcitri—aurantii是重要的采后病原真菌，常会导致果实的严重腐烂和重大的经济损失。从自然发病的柑橘果实上分离柑橘酸腐病菌，并对其进行鉴定。采用菌丝生长速率法，测定酸腐病菌对3种常用药剂的敏感性。利用扫描电镜观察其在果实上的侵染过程。从产生的细胞壁降解酶、有机酸和毒素等方面，对酸腐病菌的致病机理进行初步研究。采用紫外可见分光光度法，测定离体(invitro)和活体(invivo

2、)条件下病菌产生的细胞壁降解酶活性。利用HPLC测定病菌产生的有机酸的种类。通过有机溶剂萃取和(NH4)2S04沉淀，从病菌发酵滤液中提取毒素，活体上测定其生物活性。通过invitro和invivo筛选，获得对酸腐病菌有明显抑制作用的酵母菌株Wf-b．1。Wf-b．1为已知的酵母菌株，经实验室鉴定为球有孢圆酵母Torulasporaglobosa，并从不同接种浓度、不同接种时间和酵母在果实伤口处的生长动态等方面，对其抑制效果进行评价。主要的研究结果如下：1．经分离、纯化获得7株柑橘酸腐病菌，并通过形态学特征、果实发病症状和rDNA．ITS序列分析对其进行鉴定，并构建基于rDNA．ITS的

3、系统进化树，发现其与Geotrichumcitri-aurantii亲缘关系更近。2．药敏感性测定显示，酸腐病菌对双胍盐极敏感，EC50低于90I．tg／L，而对咪鲜胺和抑霉唑不敏感，两者的EC50在20000．60000肛g／L之间。3．扫描电镜观察其在果实上的侵染过程，发现孢子附着在果实表面，6h之内孢子萌发长出芽管，菌丝向伤口处趋向生长。在缺乏营养的条件下，36h之内菌丝断裂即可形成节孢子。同时发现病菌不通过气孔侵染果实。4．对其致病机理进行初步研究，发现酸腐病菌在离体和活体培养条件下，均可产生两种活性较高的胞壁降解酶PG和PMG，在果实发病部位PG的最高酶活出现在84h，PMG最

4、高酶活出现在60h，说明其在致病过程中起重要作用；研究其产生的酸碱物质发现，活体接种可导致腐烂果实pH的明显降低，酸腐病菌在离体培养和活体接种培养条件下都可产生有机酸，果实发病部位检测到葡萄糖酸的存在；研究其致病毒素发现，粗毒素大部分存在于水相中，为极性高的化合物。5．筛选到对酸腐病菌有明显抑制作用的酵母菌株Wf-b．1。评价其对酸腐病的抑制效果，发现Wf-b．1的悬浮液浓度高于病原菌孢子浓度(1x106spores／mL)时，抑制效果较好；Wf-b．1同时或先于病原菌接种，才能达到抑制效果；在有病原菌接种华中农业大学2012届硕士研究生学位论文时，Wf-b．1在果实伤口处的种群生长动态

5、更为稳定。Wf-b．1具有作为生防酵母的潜力，其生防效力的评价和作用机理有待进一步的研究。关键词：Geotrichumcirri—aurantii；鉴定；PG；PMG；有机酸；筛选；Wf-b．1；抑制效果2柑橘酸腐病菌的致病机理及其拮抗酵母的研究AbstractGeo舭humcitri—aurantii，oneofthemostimportantpathogenicfungiofcitruspostharvest，frequentlycausesseriousfruitdecayandlargeeconomicloss．Pathogenicisolatesfromthenaturally

6、rottedcitrusfruitwereisolatedonpotatodextroseagar(PDA)，andidentifiedasGcirri—aurantii，thecauseofcitrussourrot．／nvitrosensitivityofpathogentothreefungicidesWastestedbyinhibitinggrowthofmyceliainPDAmedium，whichweresupplementedwithvariousconcentrationsofprochloraz、imazalilorguazatine．Andtheinfection

7、processofGcitri—aurantiionartificiallyinoculatedfruitsWasobservedbyusingsanningelectronmicroscope(SEM)．Forresearchingpathogenicmechanism，threepotentialfactorsproducedbypathogenwereinvestigated，whichincludedwellcell—deg