来氟米特对子宫内膜异位症大鼠作用的实验研究

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1、河北医科大学硕士学位论文来氟米特对子宫内膜异位症大鼠作用的实验研究姓名：童玲玲申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：陈素琴201203中文摘要来氟米特对子宫内膜异位症大鼠作用的实验研究摘要目的：本研究采用自体移植法建立大鼠子宫内膜异位症模型，观察来氟米特作用于大鼠子宫内膜异位症(Endometriosis，EMT)模型的整个影响过程，检测大鼠模型异位灶中激酶转录蛋白(Transcription，p-STAT)和细胞信号转导抑制因子(cellsignalinginhibitoryfactor，SOCS)mRNA表达情况，探讨来氟米

2、特对子宫内膜异位症大鼠模型的作用机制。进一步证实免疫调节剂治疗子宫内膜异位症的策略具有可行性，为子宫内膜异位症的临床治疗提供新的治疗策略和靶点以及实验依据。方法：lSD大鼠子宫内膜异位症模型的建立9周龄雌性、性成熟、未孕、健康SD大鼠40只，体重(200_-4-80)g，由河北省实验动物中心提供(合格证号：1011030)，采用自体移植法构建动物模型。该研究符合1983年赫尔辛基宣言的原则，并得到河北医学院伦理委员会的批准，按Vernon等的方法用自体移植法手术建模。术前5天给予每天乙烯雌酚200mg／kg灌胃，通过雌激素催情，使所

3、有大鼠在统一处于动情期时开始造模。在无菌环境下，以浓度为439／L的水合氯醛300mg／kg腹腔注射麻醉，备皮消毒，腹中线耻骨上lcm处切开约2cm长切口，逐层打开腹壁各层，分离出大鼠的右侧子宫，自远端0．5am处往近端方向结扎子宫部分血管和需切除的子宫上下端，切取约1．5am长右．侧子宫，去除浆膜外月1日：5肪组织，放入生理盐水中，快速纵向切开子宫腔，切取5mm×5mm的两个片段分别缝于左右两侧腹壁，令其内膜面面向腹壁，剩余的一块送病理确诊为子宫组织。术后连续肌肉注射庆大霉素0．1ml／只，每天1次，共5天，预防感染。术后第5日开

4、始乙烯雌酚每天50mg／kg灌胃，连续5天。目的是促进移植内膜生长，提高成膜率。2模型检测与纳入标准模型建立的第四个星期，二剖腹探查，观察移植病变增长，按常规建模实验方法判断子宫内膜移植成活标准：移植内膜体积增加，形成一个浅红色或暗红色结节状球泡，被结缔组织覆盖，周围有新生血管的形中文摘要成，质地柔软，薄壁，内有透明液体积聚，囊泡高度超过2毫米，或病理检查证实移植子宫内膜上皮细胞，腺体和间质生长为建模成功。取组织活检标本送病理检查(见图lb)。3实验分组和给药将符合纳入标准的大鼠随机分为四组：空白对照组、来氟米特高、低剂量组及达那唑

5、组。药物组用药量根据《实验动物学》大鼠换算标准“每2009大鼠给药剂量为60kg成人药物剂量的0．018倍”换算得出。空白对照组无药物治疗，仅每天灌胃给予同体积0．15％羧甲基纤维素水，治疗组来氟米特高剂量组、低剂量组分别按每天35mg／kg和lOmg／kg灌胃给予含来氟米特的0．15％羧甲基纤维素水2ml，共3周；达那唑组按每天25mg／kg灌胃给予含达那唑的0．15％羧甲基纤维素水2ml，共3周。4指标检测方法4．1测量异位灶体积二次剖腹时游标卡尺测量异位结节长、宽、高，根据公式(体积V=O．52X长cmX宽cmX高cin)计算

6、异位灶体积，记作V。。用药3周后再次开腹测量异位灶体积记作V：。同时取异位灶组织分别放于PE管中放入液氮罐中保存，以备后面蛋白检测和mRNA检测。4．2p-STAT蛋白检测取大约500—600mgPE管中异位组织加lml提取液匀浆提取，4"C12000r／min离心5min，取上清，加入等体积2xSDS上样缓冲液，100℃中煮沸5min。(如果目的蛋白含量小于Western检测的敏感度，可将上清液进行冷冻干燥浓缩)。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样等量总蛋白。利用水浴式电印迹法将蛋白转移至膜上。室温振荡封闭膜2h后，加入1：250(

7、封闭液稀释)的第一抗体，室温缓慢摇荡2h，用PBS—Tween洗膜3次后，再加入1：5000(封闭液稀释)的HRP标记的第二抗体，室温振摇lh，PBS-Tween充分洗膜后，将膜浸入DAB显色液中，室温充分显色后，立即用蒸馏水洗膜，然后将膜转入PBS中观察、照相。密度扫描仪扫描胶片，以B—Actin蛋白灰度值为内参照，行半定量分析。4．3细胞信号传导抑制因子(SOCS)一lmRNA检测Tirol法提取总mRNA后，测定核酸浓度及纯度(0D260：0D280>I．8)，取等量mRNA进行逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)，SOCS上

8、下游引物为：5中文摘要

9、-CGCTCCCACTCTGATTACCG-3’和5’-CG敞GCCATCTTCACGCTGA-3’，扩增片段为189bp，反应条件：预变性94。C3min，94℃35s，60℃35s，72℃35s，36个循环