内含肽介导被拆分的barnase毒蛋白功能重建

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1、西南大学硕士学位论文内含肽介导被拆分的Barnase毒蛋白功能重建姓名：孙路路申请学位级别：硕士专业：蔬菜学指导教师：李成琼；宋洪元20120530摘要内含肽介导被拆分的Barnase毒蛋白功能重建蔬菜学专业硕士研究生孙路路指导老师李成琼教授宋洪元研究员内含肽(Intein)是存在于蛋白翻译产物(前体蛋白)阅读框架内的一段氨基酸序列，在前体蛋白转变为成熟蛋白的过程中，通过反式剪接，内含肽被剪切释放出来，游离于成熟蛋白之外，而内含肽两侧的外蛋白子(外显肽)通过肽键连接成成熟的天然肽。该过程不需要特定的细胞环境以及辅助因子的

2、参与，甚至可以在体外进行。内含肽因其独特的剪接功能在蛋白质工程、基因诊断和治疗、转基因植物研究等领域有着广阔的应用前景。来自解淀粉芽胞杆菌的B锄aSe蛋白属于细胞毒蛋白，广泛用于植物雄性不育、无籽果实、植物抗病性提高等方面的研究。研究表明，内含肽介导的蛋白剪接过程中，内含肽类型、内含肽与外显肽(exteill)剪接位点的氨基酸序列变化对剪接效率影响很大。因此，本研究选用两种天然断裂型内含肽SspDn扼和NpuDnaE，以B锄ase细胞毒蛋白为拆分对象，研究不同内含肽之间、杂合内含肽以及拆分位点处氨基酸变化对反式剪接效率的

3、影响，从而为上述内含肽在B锄ase蛋白以及其他功能蛋白的拆分以及功能重建方面的研究提供参考。本研究将B锄aSe蛋白拆分为N端和C端外显肽(拆分处氨基酸不同)并分别与SspDnaE和NpuDn也断裂型内含肽的N端和C端融合构建融合基因。N端和C端融合基因之间组成不同的组合(16个组合)，分别从原核细胞、原核蛋白表达、真核细胞表达三个方面对其反式剪接效率进行了研究。获得的主要研究结果如下：1．利用原核细胞共表达分析了内含肽介导的反式剪接功能将SspDnaE内含肽基因、NpuDnaE内含肽基因N端和C端分别与分拆后的Bam嬲e

4、蛋白N端和C端连接，获得了四对基因：SN基因和sC基因、SNG基因和scG基因、SNz基因和scz基因、NN基因和NC基因(融合基因均为本实验室按甘蓝密码子偏好性合成保存)。将所有N端融合基因插入原核表达载体pETDu以1，获得抗氨苄青霉素的表达载体；所有的C端融合基因插入原核表达载西南大学硕士学位论文体pACYCDIuet．1，获得抗氯霉素的表达载体。然后将N端融合基因表达载体与C端融合基因表达载体组成不同的组合(共计16种组合)共转化大肠杆菌BL21，通过大肠杆菌菌落的生长检测内含肽能否成功介导分拆后的Bam豁e毒蛋

5、白反式剪接。双抗性平板(加np+Cm)共转化结果分为三种：(1)无菌落生长。包括NN+NC、NN+Sc、NN+ScG三个组合。(2)平板上能长双抗菌落，但菌落中质粒表现不稳定。这类组合又分为两类，一类是平板能长少量菌落，但质粒不稳定，包括SN+NC和SNZ+Nc两个组合；一类是平板能长大量菌落，但质粒不稳定，包括SNG咐C、SN+SCZ、SNG+SCZ、SNZ+SCZ、NN+SCZ五个组合。(3)平板上能长大量双抗菌落，且菌落中的质粒表现稳定。包括SN+SC、SNG+SC、SNZ+SC、SN+SCG、SNG+sCG、SN

6、Z+SCG六个组合。原核细胞表达的结果表明NpuDnaE内含肽本身能介导分拆后的B锄aSe蛋白高效剪接，同时N”DnaE内含肽的N端与SspDnaE内含肽C端之间也能高效剪接；SspDnaE内含肽的剪接效率低，N端内含肽和C端内含肽均为sspDnaE内含肽时不能实现有效剪接。C端外显肽第一个氨基酸为Ser或CyS对NpuDnaE内含肽的N端剪接效率无影响；C端融合基因外显肽第一个氨基酸为Cys，对SspDnaE内含肽剪接效率的提高有帮助；添加源自于sspDnaE内含肽原始外显肽氨基酸残基KFAEY和CFNKS有利于剪接反

7、应的发生但该添加对NN基因的剪接效率有影响。2．在蛋白质水平验证内含肽介导的被拆分的B锄aLse毒蛋白N端和C端的反式剪接将Bam2use蛋白N端第11位氨基酸由础a突变成为G1y，B锄aSe蛋白C端第102位的His突变为船，使突变后的BanlaSe蛋白失去了毒性功能，便于在大肠杆菌中表达。将N端融合基因(BanlaSeN+缸einN)和C端融合基因(inteiIlC+BamaSeC)组成不同组合插入pETDuet．1的不同表达框之间获得蛋白共表达载体，转入大肠杆菌中表达，SDs．PAGE电泳分析蛋白大小和剪接情况。结

8、果表明：(1)N端和C端蛋白能表达且能反式剪接并有目标蛋白B锄aSe的生成，包括pETNNm．NCm、pETNNm．SCGm、pETNNm．SC2rm．、pETSNZm．SCZIn、pETSNm．SCZm五个双基因表达载体，与原核细胞表达结果相一致。(2)N端和C端蛋白能表达但未有目标蛋白BamaSe的生成，包括pE