新型断裂蛋白质内含子介导的蛋白质内部位点特异性标记

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1、学校代码：10255作者学号：2150465新型断裂蛋白质内含子介导的蛋白质内部位点特异性标记INTERNAL-SITE-SPECIFICPROTEINLABELINGTHROUGHTRANS-SPLICING学科专业：生物化学与分子生物学作者姓名：张露指导教师：林瑛副教授答辩日期：2018.01.18国家自然科学基金（项目编号：31570721，31470836）；教育部直属高校学校特色项目（项目编号：TS2011DHDX025）；上海市科委攻关项目（项目编号：14521100700）；新型断裂蛋白质内含子介导的蛋白质内部位

2、点特异性标记摘要蛋白质的标记和修饰对于研究蛋白质的功能和结构是不可或缺的。目前，随着蛋白质标记和修饰技术的不断发展和成熟，蛋白质位点特异性的标记在生物领域有着大量的潜在应用。其中在蛋白质的功能研究方面起到了重要作用，例如研究信号通路相关蛋白质时，就需要体外表达目标蛋白且进行标记或修饰；另外利用核磁共振测目标蛋白结构时，也需要对目标蛋白进行标记。为了达到目标蛋白位点特异性的修饰和标记，目前，存在很多基于分子生物学和化学的蛋白质标记或修饰的方法，但是它们都有自身的缺点，且大部分只能做到对目标蛋白质末端位点的标记做不到内部位点的特异性

3、的标记。蛋白质的反式剪接（proteintrans-splicing）技术可以说是为蛋白质位点特异性的标记提供了新的方法。首先，蛋白质的反式剪接即由断裂蛋白质内含子介导的。断裂蛋白质内含子的特点是由两部分组成，命名为断裂蛋白质内含子的N端（??）和断裂蛋白质内含子的C端(??)，它们分别位于两个开放阅读框中（openreadingframe，ORF）。当N端和C端的蛋白质内含子分别翻译成熟后，??和??能够重新识别，并且形成具有催化功能的活性中心，从而进行蛋白质的反式剪接。最终断裂蛋白质内含子被剪切下来，蛋白质内含子两侧的外显子

4、通过肽键连接起来。目前利用断裂蛋白质内含子已经实现了蛋白质末端的标记与修饰，但是仍然没有做到蛋白质内部位点特异性的标记与修饰。而本文实现了对蛋白质内部位点的特异性标记。这也是首次利用断裂蛋白质内含子实现蛋白质的内部标记。本课题最终选取了TE3S11和RBS1两种新型的断裂蛋白质内含子。其中S1型断裂蛋白质内含子的N端仅包含有11个氨基酸，S11-1-型断裂蛋白质内含子的C端仅包含有6个氨基酸。可用于目标蛋白位点特异性的荧光基团的标记。将麦芽糖结合蛋白（maltosebindingprotein，MBP）和TE3S11N（S11型

5、断裂蛋白质内含子的N端）融合，形成N端前体蛋白；TE3S11C（S11型断裂蛋白质内含子的C端）、标有荧光基团FITC的赖氨酸和RBS1N（S1型断裂蛋白质内含子的N端）融合形成中间前体蛋白；RBS1C（S1型断裂蛋白质内含子的C端）与硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）融合形成C端前体蛋白。化学法合成中间前体蛋白。利用AmyloseResin纯化可得到N端前体蛋白，利用Ni2+-NTA纯化可得到C端前体蛋白。三种前体蛋白需要按照摩尔比1:1:1在室温下进行蛋白质的反式剪接，最后通过SDS-PAGE、WesternBlo

6、t、荧光扫描以及质谱鉴定终产物，判断是否可以实现蛋白质内部位点特异性的标记。最终结果表明，本文实现了对目标蛋白内部位点特异性的标记。相比较已有的技术，本文中涉及到的技术更为简便、通用和真正实现了蛋白质内部位点的特异性标记。为蛋白质的标记开辟了新的方法。在蛋白质工程中具有很大的潜在应用。关键词：位点特异性标记；断裂蛋白质内含子；蛋白质的反式剪接；荧光基团FITC-2-INTERNAL-SITE-SPECIFICPROTEINLABELINGTHROUGHTRANS-SPLICINGABSTRACTProteinlabelingis

7、essentialforthestudyofproteinfunctionandstructure.Nowaday,withthecontinuousdevelopmentandmaturationofproteinlabelingtechnology,proteinspecificsitelabelinghasbeenwidelyusedinthefieldofbiologicalscience,especiallyinthestudyofproteinfunction.Inordertoachievesite-specifi

8、cmodificationandlabelingofthetargetprotein,manymethodsbasedonmolecularbiologyandchemistryforproteinlabelinghavebeendevelopedatprese