表面等离子技术结合滚环扩增法检测丙型肝炎病毒

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文表面等离子技术结合滚环扩增法检测丙型肝炎病毒SurfacePlasresonancetechnologycombinedwithlasmonresonancecomDInewitrollingcircleamplificationfordetectofHCV课题来源：国家自然科学基金项目(30972827，81171667)；质检总局项目(2010IK212)；深港创新圈计划(联合资助)项目(ZYB200907090128A)；专业名称流行病与卫生统计学学位申请人季明辉指导教师胡贵方副教授答辩委员会

2、主席答辩委员会成员顾大勇研究员王声滂教授陈思东教授陈维清教授江晓玲副教授陈清教授论文评阅人赵卫教授胡旭初副教授2012年5月31日广州＼删Y2㈣257611表面等离子技术结合滚环扩增法检测丙型肝炎病毒硕士研究生：季明辉指导老师：胡贵方顾大勇摘要研究背景和目的目前常规检测丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)的方法主要包括核心抗原检测、抗体检测以及核酸检测。多年以来，很多研究试图建立血液中各种HCV抗原抗体以及核酸的检测方法，但由于人体血液中HCV抗原抗体及核酸含量过低，用这些常规方法有时会无法检测出HCV。HCV核心

3、抗原检测方法主要是用双抗体夹心法检测人体血清中的丙型肝炎核心抗原，该方法的基本步骤是：用基因工程制备核心抗原进行小鼠免疫后获得纯抗HCV核心抗原的单抗作为固相包被物，配合使用辣根过氧化物酶标记物的2抗，与血清中的HCV核心抗原反应，显色后进行定性或定量测定。该方法检测具有延后性，而且灵敏度不高。另外一种检测HCV的方法是将HCV病毒经过逆转录成cDNA，再通过PCR将cDNA扩增进行检测。但是由于血液中的RNA浓度低，有时并不能检测到HCV的RNA，所以传统的方法不能满足丙肝病人的血清或者分泌物中极低浓度的RNA检测。近年来，表面等

4、离子共振(surfaceplasmonresonance，SPR)已逐步成为研究和识别生物活性材料亲和力作用的主要方法之一。SPR传感器已逐步应用到分析抗原抗体反应、观察DNA的杂交、诊断细菌和病毒引起的疾病和观察血摘要液凝固等。SPR传感器之所以能够将具有相似化学结构的混合物区分开，是因为SPR能够识别这些分析物，并且这些分析物能够和固定在SPR传感器表面上的生物活性物质发生特异性反应。SPR传感器还可以免标记、实时监测分析物和活性物质之间发生的反应。SPR传感器不仅可以监测固定在材料上的分析物，还可以分析经过解离新形成的混合物，

5、在很多情况下，SPR可以用同一个芯片，进行同时测量。因此，目前SPR是观察配体和受体之间、抗原和抗体之间相互作用最有前景的一个方法，并且逐步应用到生物医学当中。SPR在不断扩展其应用领域时，其检测方法的灵敏度也需要不断得到提高。因为SPR方法对待测●物浓度的测定主要与物质的分子量有关，对于分子量大于1000的物质，其可测定浓度范围约为nM—pM，而对于分子量小于1000的物质，其可测定浓度范围为“M．nM。因此不断探索提高灵敏度的研究方法正成为SPR研究中的一个重要内容。DNA芯片被大量用于快速、平行检测多种DNA或RNA序列。随着

6、越来越多的斑点技术的扩展，现在使用喷墨打印或光刻生产的DNA芯片，可以在一个小面积的固体支持物上点上15000种寡核苷酸链，因此目前很多研究已将DNA芯片应用到mRNA定性定量检测和单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)的检测。随着DNA芯片技术的发展使得单个DNA芯片探测整个基因组成为可能，但对低浓度的DNA靶序列检测存在灵敏度不高的问题依然是当前芯片的主要缺点。而液相预扩增方法可克服这一缺点，例如聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)技术，可用来扩

7、增芯片分析的目标DNA。PCR技术由于其高灵敏度而被认为是DNA检测的金标准。但是，PCR技术因为需要昂贵的仪器、精确的温度控制和对其产物进行凝胶电泳分离，况且不能原位扩增，使它在芯片上的运用受到极大地限制。因而迫切需要一种高灵敏度、高通量和高速度非PCR的简单的检测分析方法。滚环扩增(roilingcircleamplification，RCA)在体外使用DNA聚合酶和环状DNA模板进行信号扩增，其基本原理是：环状模板与靶核酸杂交后在连接Ⅱ硕士学位论文酶的作用下成环；成环后的环状模板在引物的作用下扩增；沿着环状模板扩增一个循环后，

8、聚合酶合成再次到达了引物聚合酶结合位点取代新合成的DNA链；继续合成多个环状模板长度的扩增链，由此形成一条由重复的环状模板序列组成的长链DNA分子。并且由于环状模板的扩增效率比线性模板要高很多，因此单引物RCA已被广泛用于基因分型和挂