环介导恒温扩增技术用于呼吸道合胞病毒的检测

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1、环介导恒温扩增技术用于呼吸道合胞病毒的检测王滔林瑜陈俊扬叶礼鸣蒋云林(福建省立医院福建省儿科研究室350001)【摘要】目的采用环介导恒温扩增技术建立快速检测儿童呼吸道合胞病毒的方法。方法收集福建省立医院2011-2012年儿科疑似急性呼吸道感染患儿的呼吸道分泌物标木137份，同时采用环介导恒温扩增技术(LAMP)和荧光定量PCR技术检测儿童呼吸道分泌物中呼吸道合胞病毒特异性RNA,分析两者的灵敏性和特异性。结果LAMP法在恒温条件下进行，特异性好，其灵敏度和可靠性与荧光定量PCR方法相当。结论LAMP方法具有灵敏度高、特异性强等优点，仅需简易设备就能

2、快速、高效、简便地对病原微生物进行鉴定，是一种快速检测呼吸道合胞病毒的新方法。【关键词】呼吸道合胞病毒环介导恒温扩增技术(LAMP)基因检测【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2014)18-0233-02人呼吸道合胞病毒(humanrespiratorysyncytialvirus,hRSV)是引起婴幼儿冬春季下呼吸道感染最常见、最重要的病原体之一［1】。环介导恒温扩增［2］(LAMP>技术具有高效、简便等特点。为此木文采用LAMP技术对疑似呼吸道感染的患儿鼻咽分泌物中的呼吸道合胞病毒进行检测，并与荧光定量PCR技术

3、检测结果比较，探讨其临床成用价值。1材料和方法1.1材料：(1)生物试剂：BstDNA聚合酶为新英格兰biolabs公司产品，PMD19-T载体和MiniBESTViralRNA提取试剂盒购自宝生物公司。ScriptMAXTMThermoT7试剂盒由上海硕盟生物科技有限公司提供。LAMP引物由宝生物公司合成。RSV荧光定量PCR试剂盒由达安基因股份有限公司出品。⑵鼻咽分泌物样木：收集2011-2012年福建省立医院儿科(住院及门诊)疑似急性呼吸道感染患儿的呼吸道分泌物标本137份，患儿（年龄30d-14周岁）。鼻咽分泌物标本采集按［3】方法取得。1.2

4、方法1.2.1实吋荧光PCR方法检测呼吸道合胞病毒：按照说明书方法进行。1.2.2LAMP检测呼吸道合胞病毒：1.2.2.1引物设计：LAMP引物设计采用Loopamp公司的LAMPPrimerExplorer软件，参照文献［4］根据呼吸道合胞病毒2个亚型（A型、B型）基因的6个区域设计4条特异引物，包括2条外引物F3、B3，2条内引物FIP、BIP和2条环引物LF、LB。引物序列见表1、2。表1LAMP检测呼吸道合胞病毒A亚型的引物序列1.2.2.2病毒RNA抽提：按照［3］处理鼻咽分泌物样,采用MiniBESTViralRNA提取试剂盒说明书方法制

5、备RNA,-80°C保存（含RNA酶抑制剂）。1.2.2.3反转录反应:20ul反应混合物:4ulMgC12,0.5ulRNase抑制物，4ul5×反应缓冲液，2uldNTPs,5.5ulRNaseFreedH2O,lulAMVase，lul随机引物和2ulRNA样品。反应混合物于30°C温育lOmin,置42°C45min，然后99°C沸水浴5min以终止反应。1.2.2.4环介导的反转录恒温扩增反应：反应扩增体系含：l.Oul10mMdNTPs,2.5ul10×反应缓冲液，简并引物（F和B引物各5pmol,FIP和BIP引物

6、各25pmol），补双蒸水至23ul。加lul模板DNA后，95°C5min,置冰浴3min，加入lulBstDNA聚合酶。然后，62°C温育45min,80°C5min以终止反应。反应结束后取2ul反应产物，3%琼脂糖作常规EB染色电泳，观察结果。标准阳性样品RT-LAMP扩增产物作为阳性对照，蒸馏水作为阴性对照。1.2.2.5标准阳性样品的制备及反应：分段合成引物F3和B3所覆盖的呼吸道合胞病毒代表株克隆至PMD19-T载体，并亚克隆到PET-28a（+）载体，用ScriptMAXTMThermoT7TranscriptionKit从载体上转录RN

7、A,同上述方法进行LAMPo2结果2.1LAMP检测呼吸道合胞病毒结果：137份样品中38份呼吸道合胞病毒阳性，阳性标本电泳条带呈现阶梯状分布，与理论结果相符合（图略）。2.2LAMP检测与PCR反应的敏感性比较：将两份PCR法呼吸道合胞病毒阳性标本混合好按1:10梯度稀释，稀释后的样品用RT-PCR和LAMP法平行检测，比较两种方法的敏感性，结果无差异，均在1/105吋，检测不出。2.3RT-LAMP检测呼吸道合胞病毒的特异性比较：采用LAMP法检测我院微生物室所发现的各种其他病原体阳性的呼吸道分泌物标本，分析该方法的特异性。所涉及的病原体冇：甲型流

8、感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、腺病毒、等，没有出现阳性反应，显示本方法具有良好的特