番茄红素拮抗氧化应激诱导的神经元损伤及分子机制研究

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1、第三军医大学博士学位论文番茄红素拮抗氧化应激诱导的神经元损伤及分子机制研究姓名：屈明玥申请学位级别：博士专业：劳动卫生与环境卫生学指导教师：王登高201205箜三至堕奎堂堡主堂垡笙茎——_————————————————————————————————————一番茄红素拮抗氧化应激诱导的神经元损伤及分子机制研究摘要研究背景：氧化应激是指体内活一峥(Reactiveoxygenspecies，R0s)的产生与清除失衡，进而导致组织和细胞受到氧化损伤。神经退行性疾病是一类严重威胁人类健康的常见病，现普遍认

2、为氧化应激在神经退行性疾病发生和发展中起了重要作用。因此，清除活性氧自由基和修复氧化损伤被认为是预防和治疗神经退行性疾病行之有效的策略。番茄红素(Lycopene)作为类胡萝卜素(Carotenoid)家族中的一员，是自然界存在的高效抗氧化剂，其淬灭单线态氧的速率常数是C【一生育酚的10倍，p一胡萝卜素的47倍，维生素E的100倍。番茄红素可以被人体吸收，通过“血脑屏障”进入中枢神经系统(Centralnervesystem，CNS)发挥抗氧化等生物学功能；流行病学研究也显示，长期摄入富含番茄红素的食

3、品能够有效提高老年人的认知能力和记忆功能；因此，番茄红素在氧化应激相关的中枢神经系统疾病防治方面的运用备受关注。三甲基氯化锡(Trimethyltinchloride，TMT)作为一种职业与环境危害因素，广泛应用于PVC塑料的稳定剂和防锈油漆的添加物。TMT慢性中毒多表现为神经系统功能紊乱，如头晕、记忆力减退、认知能力下降和精神异常等症状；病理表现为大脑边缘系统，特别是海马的神经元退行性改变。目前公认的TMT毒性分子机制是TMT可以诱发神经细胞内大量活性氧自由基累积，致使神经细胞发生氧化应激，最终导致

4、神经细胞功能障碍甚至凋亡。由于TMT中毒的临床和病理表现以及毒性机制与多种神经退行性疾病极为相似，近年来TMT被用于构建模拟神经退行性疾病的动物及细胞模型。因此，本课题第一部分以原代培养的大鼠海马神经元为研究对象，运用TMT建立神经退行性疾病相关的神经元氧化损伤模型，研究番茄红素对TMT诱导的神经元氧化损伤的影响及其相关分子机制，以期揭示番茄红素在氧化应激相关的神经退行性疾病防治的潜在价值。阿尔茨海默病(Alzheimer’Sdisease，AD)是一类常见的神经退行性疾病。D淀粉样肽(Beta—am

5、yloidpeptide，Ap)诱导的神经细胞氧化应激和凋亡被认为在AD的发生和发展过程中发挥关键作用。因此，为进一步探讨番茄红素在神经退行性疾病防治方面的运用价值，本课题第二部分以原代培养的大鼠皮层神经元为研究对象，运用AD建立神——第三军医大学博士学位论文————————————————————————————————————_二—二二二_——————一经元氧化损伤模型，研究番茄红素对Ap导致神经元损伤的影响及其相关机制，丰富番茄红素在神经退行性疾病防治方面的运用价值的实验依据。第一部分番茄红素拮

6、抗TMT诱导的神经元损伤及相关机制研究方法：1．采用新生Sprague—Dawley大鼠原代培养海马神经元，采用倒置相差显微镜观察神经元形态，采用1]-TublinIII神经元特异性标记物运用免疫细胞荧光法鉴定海马神经元。运用多个浓度的TMT处理不同时问诱导神经元氧化损伤，根据细胞活力变化，选择损伤程度合适的TMT处理浓度和时间建立细胞损伤模型。2．将神经元分为对照组、番茄红素处理、TMT处理以及番茄红素+TMT处理组，采用倒置相差显微镜观察处理前后神经元的形态学变化；采用CCK．8和TUNEL原位荧

7、光染色法分别观察TMT处理神经元后细胞活力和凋亡率的变化，以及番茄红素干预后的影响。3．采用DCFH—DA和Mito．SOX荧光探针分别检测番茄红素对TMT处理后神经元细胞内和线粒体内ROS水平的影响。4．采用基于钙黄绿素的荧光猝灭法和JC—l荧光探针分别检测番茄红素对TMT处理后神经元线粒体膜通道孔(mPTP)和跨膜电位(△甲m)水平的影响。5．采用细胞免疫荧光染色法和分光光度法分别检测番茄红素对TMT诱导的神经元细胞色素c释放和Caspase一3活性的影响。研究结果：1．原代培养第8天的SD大鼠海

8、马神经元形态正常。免疫细胞荧光结果显示非神经元细胞污染程度低，神经元纯度高。CCK．8细胞活力检测结果显示，TMT损伤神经元细胞活力呈剂量依赖和时间依赖的关系，因此选定5¨MTMT处理24h建立TMT诱导神经元氧化损伤模型，作为后续实验的条件。2．形态学结果显示，5¨M浓度的TMT处理致使神经元突触断裂，胞膜不完整，胞体膨胀，胞核固缩，而1¨M的番茄红素预处理能够逆转这种损伤作用。CCK一8法检测结果显示，番茄红素显著抑制TMT导致的神经元细胞活力下降，