吡咯喹啉醌对谷氨酸损伤神经元的保护作用及机制研究

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1、博士学位论文论文题目吡咯喹啉醌对谷氨酸损伤神经元的保护作用及机制研究研究生姓名张琦指导教师姓名丁斐专业名称人体解剖与组织胚胎学研究方向神经损伤与修复论文提交日期2012年3月吡咯喹啉醌对谷氨酸损伤神经元的保护作用及机制研究中文摘要吡咯喹啉醌对谷氨酸损伤神经元的保护作用及机制研究中文摘要目的：1.观察吡咯喹啉醌（PQQ）对体外培养海马神经元谷氨酸损伤的保护作用，并初步探讨其作用机制。2.观察PQQ对谷氨酸脑内注射大鼠模型神经元损伤的保护作用，并分析其作用机制。方法：1.体外培养胚胎大鼠海马神经元，神经元特异性染色（MAP2）

2、鉴定神经元纯度；通过CCK-8法检测不同浓度PQQ（12.5µM、25µM、50µM、100µM）对正常培养海马神经元细胞活力的影响。2.建立原代培养的海马神经元谷氨酸急性损伤模型（125μM，15min），通过细胞形态观察和CCK-8法，观察PQQ对谷氨酸损伤海马神经元形态和细胞活力的影响。3.通过Hoechst33342和TUNEL染色，观察PQQ对谷氨酸损伤海马神经元凋亡的影响。4.通过Westernblot和Caspase-3酶活性检测，观察PQQ对谷氨酸损伤海马神经元凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白表达及凋亡相

3、关蛋白酶Caspase-3活性的影响。5.钙离子荧光探针Fluo-4/AM标记海马神经元，激光共聚焦显微镜下检测PQQ2+对谷氨酸诱导的Ca内流的影响。6.通过TMRM染色，检测PQQ对谷氨酸诱导的海马神经元线粒体膜电位改变的影响。7.通过活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）分析，观察PQQ对谷氨酸损伤神经元氧自由基生成及清除的影响。8.通过线粒体氧化呼吸链不同复合物的抑制剂应用，寻找PQQ在线粒体自由基清除中可能的作用靶点。I中文摘要吡咯喹啉醌对谷氨酸损

4、伤神经元的保护作用及机制研究9.通过Westernblot检测Akt、GSK3β、JNK和P38蛋白磷酸化水平的表达变化，并加入相应通路抑制剂，观察各抑制剂对PQQ保护功能的影响，寻找PQQ保护作用相关的信号转导途径。10.通过免疫荧光化学观察PQQ对谷氨酸损伤海马神经元Nrf2表达定位的影响，实时定量PCR检测PQQ对转录因子和抗氧化基因（Nrf1、Nrf2、HO-1、GCLC）的表达影响，并观察PI3K抑制剂的影响作用。11.构建谷氨酸脑内注射模型，TUNEL检测PQQ在体内对大脑皮层神经细胞凋亡的影响，FCM分析PQ

5、Q对谷氨酸脑内注射大鼠皮层细胞ROS生成的影响，并检测SOD、GSH和MDA活性及含量的变化。12.通过实时定量PCR和Westernblot检测PQQ对谷氨酸脑内注射大鼠皮层细胞转录因子和抗氧化基因（Nrf1、Nrf2、HO-1、GCLC）表达及磷酸化GSK3β表达的影响。结果：1.原代培养的海马神经元纯度较高，达95%以上，0~100μM浓度范围内PQQ对正常培养的神经元细胞活力没有显著影响。2.PQQ对谷氨酸损伤的海马神经元具有保护作用，能抑制细胞活力的下降和减少细胞凋亡的产生，并呈现剂量依赖效应，在浓度为100μM

6、时作用最佳。3.PQQ能调节谷氨酸损伤海马神经元中凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的比例，降低凋亡蛋白酶Caspase-3的活性。2+4.PQQ能稳定线粒体膜电位，减少谷氨酸诱导的Ca内流。5.PQQ通过抑制谷氨酸损伤神经元中ROS的生成及增加ROS的清除，减少氧化应激损伤。6.线粒体复合物I、III和IV抑制剂能增加海马神经元中ROS的生成，PQQ能减少复合物I和III抑制剂诱导的ROS增加，提示其作用靶点可能位于复合物I和III。7.PQQ能维持谷氨酸损伤神经元中Akt的持续活化并激活其下游GSK3β信号，同时抑制JNK

7、信号的激活。使用PI3K抑制剂可以阻断PQQ对神经元的保护作用及对凋亡蛋白比例的调节。8.PQQ能促进Nrf2的核转位和表达，增加下游ARE依赖抗氧化基因HO-1和GCLC的表达，这种作用可以被PI3K抑制剂所抑制。II吡咯喹啉醌对谷氨酸损伤神经元的保护作用及机制研究中文摘要9.PQQ对谷氨酸脑内注射大鼠具有保护作用，可以减少注射周围皮层细胞凋亡的发生和降低大脑皮层细胞ROS的含量。10.PQQ能促进谷氨酸脑内注射大鼠大脑皮层内Nrf2、HO-1和GCLC的表达，增加磷酸化GSK3β的表达，这可能与其保护功能相关。结论：P

8、QQ对体外培养的海马神经元谷氨酸损伤具有保护作用，能调节凋亡相关蛋白的比例及蛋白酶活性从而抑制细胞凋亡的发生。PQQ在体内也能拮抗谷氨酸2+诱导的大脑皮层细胞凋亡。PQQ的保护作用可能与稳定线粒体功能、减少Ca超载、降低ROS损伤和增加抗氧化基因的表达相关。PI3K/Akt/GSK3β信号途径的活化在P