吡咯喹啉醌对雪旺细胞增殖及nf

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1、吡咯喹啉醌对雪旺细胞增殖及NF【关键词】吡咯喹啉醌　雪旺细胞　增殖　NF-κB　　Abstract:［Objective］Toinvestigatetheeffectsofpyrroloquinolinequinine(P)onproliferationandexpressionofNF-κBofSchsciaticnervesofSDratsinvitro.TheSchmunofluorescenceofS-100andAra-C.Experimentalgroupol/LofPandcontrolgroupinedbyRT-PCR

2、andentas公司)；蛋白裂解液(碧云天公司)；BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱公司)；兔抗NF-κB一抗、羊抗兔二抗(SantaCruz公司)。　　1.2雪旺细胞体外培养及纯化　取3～5dSD大鼠，显微镜下无菌剥离双侧坐骨神经；D-Hanks液漂洗后移入混合酶(含0.25%胰蛋白酶和0.03%Ⅱ型胶原酶)中，于37℃空气摇床中消化40min；1000r/min离心10min，弃上清后加入5ml培养液(含10%胎牛血清)，将细胞悬液移入培养瓶中，置于37℃，含5%CO2培养箱中培养；30min后行差速贴壁去除成纤维细胞，于次日加入阿

3、糖胞苷(Ara-C，10-5mmol／L)继续杀灭成纤维细胞，换液继续培养。　　1.3S-100免疫荧光鉴定雪旺细胞　将培养的细胞PBS洗涤3次×5min；4℃、4%多聚甲醛固定10min，PBS洗涤3次×5min；加1%triton-100，37℃孵育20min，PBS洗涤1次×5min，正常羊血清封闭5min，PBS洗涤1次×5min；加兔抗大鼠S-100抗体4℃过夜；PBS洗涤3次×5mini加羊抗兔IgG-FITC，37℃避光孵育30min，PBS洗涤3次×5min。　　1.4实验分组　选择细胞密度和生长状况相同的两孔细胞分别

4、作为实验组和对照组，每组做三次重复实验：在该课题组先前的研究中我们已经得到P促进SCs增殖的最佳浓度为100nmol／L，以及最佳作用时间为72h［10］，因此本实验中采用最佳P作用浓度100nmol／L为实验组，对照组加入等量PBS。置于37℃含5%CO2的培养箱中培养，提取RNA及蛋白进行相关检测。　　1.5RT-PCR检测　加入P培养72h后用Trizol试剂法提取总RNA，采用两步法RT-PCR进行目的基因片段扩增。NF-κB上游引物序列5’-CTGATGTGCACCGACAAGTGG-3’，下游引物序列5’-GTTGATGG

5、TGCTCAGGGATGAC-3’，预期扩增产物片段大小353bp。β-actin上游引物序列5’-CCTGACCGAGCGTGGCTACAGC-3’，下游引物序列5’-AGCCTCAGGGCATCGGAAC-3’，预期扩增产物片段大小205bp。反应条件：94℃预变性10min，94℃30s、60℃30s(NF-κB)／55℃30s(β-actin)、72℃30s，进行30个循环；再以72℃延长10min。取产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像扫描系统分析。　　1.6in，12000r/min离心5min，收集上清进行BCA蛋白定量，

6、取样品进行SDS-PAGE电泳，样品分离后转移至PVDF膜。转印后加入含5%脱脂奶粉的PBS-T缓冲液中封闭1h，加入兔抗NF-κB一抗(1∶500)，4℃过夜，PBS-T漂洗；然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗兔)，室温孵育1h，PBS-T漂洗后，加入ECL化学发光剂发光，柯达胶片曝光，凝胶成像系统扫描分析。　　2.2雪旺细胞S-100蛋白免疫荧光标记　雪旺细胞经S-100免疫荧光标记鉴定，荧光显微镜下观察S-100荧光标记阳性细胞并计数，胞浆呈绿色荧光者为阳性，SCs纯度达90%以上（图2)。　　2.3P对雪旺细胞形态学影响

7、　在本实验中加入浓度为100nmol／L的P培养72h，从下图的细胞长势可见P组细胞密度及长势均比对照组要好(图3)。P促进SCs增殖主要是刺激SCs进入S期，缩短细胞从Gl期进入S期的时间，使分裂相的SCs明显增多，进而促进其增殖。　　2.4RT-PCR检测mRNA表达　使用RT-PCR技术分别对P组和对照组NF-κB的mRNA表达进行分析，结果表明P组的NF-κB的mRNA表达较对照组高(P<0.05)，即100nmol／P可以促进SCs中NF-κB基因表达增高(图4)。　　2.5期细胞的数量。　　NF-κB是近年研究较热的

8、一个基因转录调控蛋白，它广泛地参与细胞生长、分化、免疫和炎症反应，产生抗凋亡、促增殖的作用，是细胞重要的信号传递通路，可通过调节一系列基因转录、表达而发挥其抗凋亡作用。NF-κB是由两种Rel家族蛋白构成的二聚体蛋白质，