不依赖于nf-κb信号通路的细胞因子破坏血管内皮屏障功能

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1、第二军医大学博士学位论文不依赖于NF--κB信号通路的细胞因子破坏血管内皮屏障功能姓名：郭金萍申请学位级别：博士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：张传森；DeanYLi；杨向群201205不依赖于NF—KB信号通路的细胞因子破坏血管内皮屏障功能摘要一、研究背景慢性炎症的发生发展是通过不断的释放失去调节的细胞因子、大量募集炎性细胞以及增加血管通透性造成组织器官的损伤。在这～过程中，血管内皮细胞的粘附和结构屏障功能变化起到了关键作用。研究证实，炎性细胞因子如白介素113(IL．1B)在体内可以引起循环中

2、的白细胞迁出并在损伤组织间隙聚集。目前己知该反应中，白介素1B可通过与胞膜上受体结合激活髓细胞样分化蛋白88(MyDSS)介导的核转录因子r．B(NF．r．B)依赖的信号通路，促进白细胞的粘附、变形和迁出。然而对于白介素lB导致血管屏障功能的损伤，增加血管的通透性，其具体是否也依赖于NF．r,B通路的激活，目前仍不得而知。血管内皮在循环系统和周围组织间产生结构型屏障，调控血管中血浆成分和血细胞的向周围组织渗漏。血管的通透性由两种途径调节：一种是经细胞通透途径：另一种是细胞旁通透途径。在炎症反应时，细胞

3、旁通透途径对于血管内皮通透性的调节尤为重要。细胞旁通透途径主要由内皮细胞间连接调控，通过对内皮细胞超微结构的观察发现，粘附连接是血管内皮细胞间的主要连接形式。而构成内皮间粘附连接的丰要分子是血管内皮钙黏蛋白(VE．cadherin)。它是血管内皮细胞特异性钙黏蛋白，其结构和分布对于维持血管内皮细胞的牛理功能起着重要的作用。ADP核基环化因子6(Arf6)是ras超家族中的一个小分子GTP结合蛋白，属于ARF亚家族成员，分子量仅20kD左右，在真核生物细胞中广泛表达并且序列及其保守。目前研究发现ARF6

4、主要参与调节细胞质膜运输和胞内肌动蛋白装配而涉及到多种牛理功能，包括囊泡内吞、分泌、膜出芽、胞质分裂、吞噬、细胞粘连、细胞迁移等。Arf6的活化受到GTP酶激活蛋白(GAPs)干I鸟苷交换因子(GEFs)的共同调节。Arf-GAPs是负调节因子，能催化与Arf6结合的GTP水解成GDP而抑制它的活性，而Arf--GEFs是正调节因子，能促进ARF6．GDP向ARF6一GTP的转换从而激活Arf6。在我们之前的研究中发现Arf6的活化程度与血管内皮的屏障功能有密切联系：阻断Arf6激活可以稳定血管内皮，

5、激活Arf6可以增加新生血管的发生以及血管内皮通透性。探寻炎症发生时血管内皮通透性改变的机制，研究炎性细胞因子IL．1B对于血管内皮细胞影响的具体通路，都可以为存在炎症反应的疾病治疗提供解决的靶点提示。二、研究目的本课题拟研究白介素．1B通过何种信号转导途径影响血管内皮通透性；Arf6与VE—cadherin之间的关系，如何通过调控Arf6来影响VE．cadherin的表达分布，协调内皮细胞间连接稳定性：寻找IL．1B、Arf6以及VE．cadherin相瓦之间是否有联系：并选取慢性炎症的动物模型(C

6、IA)验证体外实验的结论。第二军医大学博士学位论文三、材料和方法购买HMVECs原代并进行培养扩增，第5代细胞用于实验。GTP．Arf6pulldown实验检测全细胞裂解液中Arf6GTP形式的含量。单细胞层的电阻用ECIS系统(AppliedBiophysics)检测，数据单位为欧姆。利用Transwell系统检测单细胞层对辣根过氧化物酶的渗透量。细胞免疫荧光染色、细胞膜组分分离以及Western免疫印记等方法检测HMVECs细胞膜上VE．cadherin的量及分布形态。购买带有Arf6．Q67L基

7、因片段或绿色荧光蛋白的腺病毒载体，按照适当浓度感染HMVECs，感染48小时后进行实验。购买目的基因的siRNA溶解分装后，以Hiperfect转染试剂进行两次基因干扰，第二次干扰后48小时用实验。利用PCR、酶切、连接、转化、筛选、测序以及扩缯培养、质粒抽提等方法构建并获得大量MyD88和ARNO的全长及功能片段载体，以脂质体将目的片段转染至293T细胞中，转染48小时后进行免疫共沉淀实验。牛II型胶原蛋白溶液与完全弗氏佐剂注射DBA／1J小鼠，21天后与不完全弗氏佐剂再次注射得到胶原诱导性关节炎动

8、物模型。利用关节炎指数进行评分分组，经过DMSO、SecinH3以及Enbrel⑧处理后，进行组织学检查。三、结果1．IL．1B诱导血管通透性的增高不依赖于NF-KB通路加入核因子．1(B抑制因子激酶(IKK)的抑制剂(SC514)可以阻断IL．1B诱导的NF．rd3由胞浆移入细胞核，但是它不能阻止IL．1B诱导的HMVECs单细胞层跨膜电阻降低，对辣根过氧化物酶的通透性增高以及细胞膜表面VE．cadherin减少。在内皮细胞培养过程中加入已知IL．1B