tnftnfr1信号通路和内质网应激在氧氟沙星和麻保沙星诱导的幼龄犬关节软骨细胞凋亡作用中的机制研究

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1、华中农业大学硕士学位论文TNF/TNFR1信号通路和内质网应激在氧氟沙星和麻保沙星诱导的幼龄犬关节软骨细胞凋亡作用中的机制研究姓名：张福涛申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：丁明星201206TNF脚R1通路和内质网应激在氧氟沙星和麻保杀星对幼龄犬关节软骨细胞凋亡中的机制研究摘要喹诺酮类(Quinolones，QNs)抗生素由于其抗菌谱广、抗菌活性高、生物利用度高、很少与其它药物产生交叉耐药性等优点而被广泛应用于临床。但是大量的动物实验表明QNs具有关节软骨毒性，尤其以幼龄动物最为明显，因此限制了QNs在临床上的应用。目

2、前，QNs致关节毒性机理尚未阐明。目前公认的机理主要有：QNs通过与软骨细胞B。整合素竞争镁离子而影响其功能进而引起软骨细胞损伤和QNs引起软骨细胞氧化应激而引起软骨细胞损伤。这两条假设最终通过线粒体通路引起软骨细胞凋亡。死亡受体活化和线粒体损伤途径是细胞凋亡的两条经典途径，近年来研究发现内质网应激也参与了凋亡信号的启动，内质网作为细胞凋亡的新的更早的起始点受到极大重视。本实验旨在阐明是否有其他的凋亡途径参与了QNs致软骨细胞凋亡过程，进一步阐明QNs的关节毒性机理，为临床用药起到一定的指导意义。本实验利用第三代细胞进行试验。用

3、20}tg／mL，50p．g／mL和1001xg／mL的氧氟沙星和麻保沙星作用细胞2h、8h和24h，MTT法检测各个浓度时间点药物作用后的细胞存活率；流式细胞仪测定各浓度时间点的细胞凋亡率；采用qRT-PCR方法检测各浓度时间点死亡受体基因肿瘤坏死因子0【(TNFa)、肿瘤坏死因子受体1(TNFRl)、TNFR相关死亡蛋I刍(TRADD)、FAS相关死亡蛋I刍(FADD)和Caspase．8，内质网应激基因糖调控蛋白(GRP78)、Caspase．12、生长停滞和DNA损伤诱导蛋白153(GADDl53)和需钙蛋白酶(Calp

4、ain)基因以及抗凋亡基因Bcl一2和核转录因子(NF．1cB)的mRNA水平变化；根据qRT-PCR结果，采用WesternBlot方法检测死亡受体标志性蛋白TNF／TNFRl在8h(TNF、TNFRlmRNA高表达点)和内质网凋亡标志性蛋白Caspase．12在24h(Caspase．12mRNA高表达点)的表达情况。分析氧氟沙星和麻保沙星处理软骨细胞是否有死亡受体和内质网凋亡途径的参与。实验结果表明在24h内：氧氟沙星和麻保沙星以浓度和时间依赖关系引起体外幼龄犬关节软骨细胞存活率下降，凋亡升高；qRT-PCR结果表明两种药

5、物处理细胞后，能够诱导软骨细胞TNF／TNFRl信号通路因子TNF、TNFRl、TRADD、FADD和Caspase．8mRNA表达，表达在2h或者之前开始表达，在8h达到高峰(氧氟沙星Caspase．8在24h达到高峰1，之后下调；能够诱导内质网应激因子GRP78、Caspase．12、GADDl53和Calpain基因mRNA水平上调，氧氟沙星处理组Caspase．12、GADDl53华中农业大学2012届硕士研究生学位论文和CalpainmRNA在2h或者之前开始表达，Caspase．12和GADDl53mRNA在8h高表

6、达CalpainmRNA在24h高表达，GRP78在24h之前与对照组无显著性差异；而麻保沙星处理组Caspase。12、GADDl53和GRP78mRNA在2h或之前开始表达，24h达到峰值，CalpainmRNA在24h前未表达。结果表明内质网应激可能直接参与软骨细胞的凋亡过程。麻保沙星比氧氟沙星能够更早的启动GRP78的表达，表明麻保沙星能够更早的启动内质网保护性机制，暗示麻保沙星的毒性较小。两种药物处理后抗凋亡因子Bcl．2和NF．r．BmRNA在3个时间点也有显著性差异，都在2h或之前启动表达，8h高表达之后下调。麻保

7、沙星诱导软骨细胞表达Bcl．2量显著高于氧氟沙星组，提示麻保沙星的毒性较小。而NF．rd3mRNA的表达氧氟沙星组高于麻保沙星组，可能是因为TNFRl诱导表达NF．vd3的结果。死亡受体标志性蛋白TNF／TNFRl和内质网凋亡标志性蛋白Caspase。12分别在在8h和24h存在表达。本研究建立了软骨细胞的培养方法，研究了喹诺酮类药物氧氟沙星和麻保沙星作用幼龄犬软骨细胞后24h内死亡受体通路和内质网通路相关因子的表达，首次发现TNF／TNFRl信号通路和内质网凋亡通路能够在氧氟沙星和麻保沙星的诱导下被激、-一沽。关键词：氧氟沙星

8、；麻保沙星；TNF／TNFRl；内质网应激；细胞凋亡AbstractQuinolones(QNs)arewidelyusedfortheirbroadantibacterialspectrumandgoodantibacterialactivities，desi