sqstm1p62在肝癌缺氧、营养缺乏微环境中的作用及机制研究

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1、复旦大学博士学位论文SQSTM1/p62在肝癌缺氧、营养缺乏微环境中的作用及机制研究姓名：顾澄宇申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：樊嘉2012-04复旦大学博士学位论文中文摘要原发性肝癌在全球常见恶性肿瘤中居第六位，在肿瘤相关性死亡中居第三位。我国肝癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中均排在第二位，死亡率为26．3／100，000，占全球每年因肝癌死亡人数的半数以上。虽然在肝癌早期诊断、肝脏移植、手术切除肿瘤方面取得了诸多进步，肝癌患者的生存率得到提高，但是只有30％～40％的患者适宜行根治性手术。在仔细挑选的患者中

2、，根治性手术切除和肝移植的5年总体生存率为70％。但即使是根治性切除，5年内仍有60％～70％的患者出现转移复发，肝癌患者的总体5年生存率仍只有30％左右。肝内复发和肝外转移仍然是肝癌患者长期生存不可逾越的障碍!因此，探索肝癌转移复发的机制，寻找有效的抑制途径，已成为进一步提高肝癌生存率的关键。自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，以细胞内双层或多层膜样结构包裹胞浆或细胞器形成囊泡样自噬体为形态学特征。现己认识到自噬对蛋白质和细胞器的降解、利用的重要性，在生命体的生长发育及应对不利的环境应激(如低氧、营养缺乏、生长因

3、子缺乏等)中起关键作用。最新研究发现，自噬功能失调是人类恶性肿瘤的一个新特征。在肿瘤形成的初始阶段，自噬限制肿瘤生长；相反地，在肿瘤的晚期阶段，肿瘤细胞通过自噬促进肿瘤生长。由于自噬与细胞代谢、蛋白质和细胞器周转、细胞生存等密切相关，自噬在肿瘤中的作用呈现动态变化，具有高度的复杂性。SQSTMl／p62是一种多功能的泛素化结合的折叠蛋白，在自噬调控、蛋白酶体通路、NF．r．B等信号通路中起重要作用。自噬抑制导致p62过度表达，并可通过调节NF．r,B信号通路、ROS积聚、DNA损伤、促进肿瘤细胞增殖。p62积极参与肿

4、瘤的发生、发展。本研究通过分析比较不同恶性程度及侵袭能力的肝癌细胞系中p62、自噬基因(At95、Beclin1)的表达情况，分析p62与肝癌细胞自噬能力之间的关系；观察在缺氧、营养缺乏情况下，p62的动态变化过程及对细胞生长、凋亡的影响，初步揭示p62在肝癌缺氧、营养缺乏微环境中的作用。通过组织芯片技术，在大规模样本群中研究p62在肝癌组织中的表达情况及其与临床预后的关系。通过干预p62表达有望寻找到新的治疗靶点，提高肝癌患者的生存率。．2．复旦大学博士学位论文中文摘要第一部分SQSTMl／p62在人肝癌细胞系和肝

5、癌组织中的表达情况研究本部分旨在研究p62在人正常肝细胞系、肝癌细胞系和肝癌组织的表达情况，初步探讨p62与自噬相关基因At95和Beclinl之间的关系。选用正常肝细胞系L-02和常见的肝癌细胞系Hep3B、HepG2、Huh7、SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97一H和HCCLM3共7种不同的人肝癌细胞系，通过Real-timePCR、Westernblot方法检测上述细胞系中p62、At95和Beclin1的mRNA和蛋白表达情况；采用免疫荧光方法，观察Huh7、SMMC．7721、MHCC97．

6、H和HCCLM3四个细胞系中p62蛋白的表达分布情况。应用免疫组化方法观察p62在人肝癌组织及癌旁组织中的表达情况，在肿瘤和癌旁组织(距离肿瘤>2cm)的配对样品中检测p62、At95和Beclinl的mRNA表达水平，进行统计学分析。通过构建稳定敲减Beclin1的SMMC．7721和MHCC97．H细胞株，观察在基础自噬水平抑制的情况下p62蛋白的表达变化。结果发现，p62mRNA和蛋白在各肝癌细胞系中均有表达，与L．02比较具有显著性差异(P<0．001)。Westernblot和免疫荧光方法检测p62蛋A表达

7、情况符合Real—timePCR结果，MHCC97．H和HCCLM3中p62mRNA和蛋白均高表达；p62蛋白主要分布在细胞浆中。MHCC97．H、HCCLM3中At95和Beclin1在mRNA、蛋白水平均较正常肝细胞系L．02中低，而p62表达显著高于L．02细胞系。通过敲减Beclin1抑制基础自噬水平，SMMC．7721和MHCC97．H细胞中p62表达增加。在人肝癌组织标本中，p62蛋白主要存在于肿瘤细胞的胞浆中，癌旁组织中表达水平极低。肝癌组织中At95和Beclin1mRNA表达水平均显著低于正常肝组织

8、(尸<0．001)，肝癌组织中p62mRNA表达高于正常肝组织(尸2cm)中的表达水平。研究表明，在基础自噬水平较高的细胞系中p62的表达水平普遍较低，而基础自噬水平较低的细胞系中p62高水平表达。抑制自噬，p62表达增加