ppe68重组bcg诱导机体免疫应答的探讨

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1、重庆医科大学硕士学位论文PPE68重组BCG诱导机体免疫应答的探讨姓名：王静娴申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：杨春201205PPE68重组BCG诱导机体免疫应答的探讨1摘要目的：构建带有结核分枝杆菌PPE68基因和分枝杆菌复制子orM基因的穿梭质粒pBudCE4．1／PPE68／o洲，将其电转入BCG，构建PPE68重组BCG，用其免疫BALB／c小鼠，与BcG和D1她疫苗比较，探讨其诱导BALB／c小鼠体内免疫应答特征。方法：以p乃佃3为模板，用PCR法扩增出分枝杆菌复制子orM基因，将其亚克隆入已含PPE68基因的带有双

2、启动子的真核共表达载体pBudCE4．1的NlleI位点中，经过酶切测序鉴定后，得到穿梭质粒pBudCE4．1／PPE68／odM；将PPE68基因转染入RAW264．7(小鼠巨噬细胞株)，通过RT-PCR和W舀tem-blot检测PPE68的表达。用鉴定正确的穿梭质粒pBudCE4．1／PPE68／orM电转入BCG中，制备PPE68重组BCG，菌落PCR法进行鉴定，扩增。用鉴定正确的PPE68重组BCG皮内免疫BAI，B／c小鼠，同时设DNA疫苗组、空载体组、BCG、orjM重组BCG和生理盐水组对照组。于末次免疫后2周，分别检测小鼠

3、体内IgG2a、几．12、Ⅲ-4以及ⅢN_y水平；特异性蛋白刺激后淋巴细胞l本课题由国家自然科学基金(30771922，30901280)资助2增殖状态：CDk4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞数及CD4+／CD8+比值：观察小鼠肺脾器官荷菌量、组织病理改变情况和免疫组织化学结果。结果：RT-PCR、Westem-blot法检测PPE68基因在巨噬细胞内的表达。成功地构建了PPE68重组卡介苗，PPE68重组末次免疫后2周PPE68重组BCG组较BCG组血清IgG2a水平明显升高口<0．05)；ⅢN-Y和Ⅲ．12水平高于生理盐水组(P>o

4、．05)，但低于BCG组和DNA疫苗组口0．05)；与BCG组和DNA疫苗组相比，PPE68重组BCG组小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞百分比增加，CD4+／CD8+T细胞比值降低：免疫组化法检测到小鼠肺组织中PPE68的表达：肺组织轻度充血程度与BCG组相当，余未见明显病理改变、脾肺无菌落生长。结论：成功构建PPE68重组BCG疫苗，该疫苗可诱导BAI，B／c小鼠体内IgG2a水平升高

5、，Ⅲ．12和巧．N-Y含量增加，脾淋巴细胞的增殖明显，CD4叮细胞和CD8+T细胞明显增加，提高机体Thl型免疫效应，为进一步研究其抗MTB的免疫保护作用奠定了基础。关键词：PPE68；结核分枝杆菌；重组BCG；免疫应答STUDYoNIM唧NERESPoNSE肿UCEDBYPPE68RECoM嘬矾ANTBCG矾MICEMoDELobje咖：ConS仃uctash眦le—plaSmidpBudCE4．1／PPE68／odMmatmecod岖sequenceofo心压舶mmepkIllidp乃仰3、vaSsubcloned证tome^％厂sk

6、of廿1eeukaryoticcoexpressionpk血dpBudCE4．1伊PE68，aIldtllen仃ansfected洫toBCG．BALB／cmice、Ⅳelr-emurl泣edwi廿1PPE68recombirmtBCGa11dtllei11衄uneresponse洒ducedbymevacc证ewasevaluated．Nk舢吣ds：TheorMgene、Vas锄plinedbyPCR盘．ompZM03andsubclonediIlt0朋Ws沁ofmeeuka巧oticcoexpressionplaSIIlidpBudC

7、E4．1伊PE68．TheshutⅡe-plasmidwasdetectedbyr．estricti、，edigestionandDNAsequencir培，andmen地msfec屯edmtomemurmemaCroph乏唔ecells．TheexpressionofPPE68genewaSdetectedbyRT-PCRarldWestern-blot．Theshuttle—plasmidwaS句ransfonned证toBCGa11didentifledbyPCRBALB／cIIlicewere幽unizedwimPPE68reco

8、mbm锄tBCG，廿leDNAVacc址，vector，BCGa11dsahnecon们lgroupswereset．Twoweeks心er4last证mlunization，t11eleVe