pai-1sirna对实验性肺纤维化大鼠caspase-3表达的的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文PAI--1SiRNA对实验性肺纤维化大鼠Caspase--3表达的的影响姓名：刘建申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：张彦萍201203中文摘要PAl．1SiRNA对实验性肺纤维化大鼠Caspase一3表达的影响摘要目的：肺纤维化是一种以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱并最终导致肺功能丧失为特征的一种疾病，是肺组织对损伤的一种动态的病理修复过程。其病理特点包括间质细胞增生、细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)异常沉积及肺组织结构的重构，其中ECM代谢失衡在肺纤维化的发生发展过程中起着重要作用。在损伤修复应答反应中，成纤维细胞，各种各

2、样的结缔组织细胞和关键的效应因子，被募集到损伤的组织中，在那里，促进ECM沉积和促进其降解因素的平衡，决定了损伤肺组织的发生和发展。肌纤维母细胞的分泌、机化、再重建以及收缩ECM、促进伤口的闭合以及上皮的再生。随着损伤组织的正常修复，凋亡使成纤维细胞／肌纤维母细胞的数量大量减少。肌纤维母细胞的凋亡失败和损伤组织的病理修复，最终导致了组织的纤维化。纤溶酶和基质金属蛋白酶是降解细胞外基质的两种主要酶类。纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶，具有纤维蛋白溶解活性，是由纤溶酶原激活物激活纤溶酶原裂解而产生，纤溶酶能够裂解细胞外基质成分，例如纤维结合蛋白，活化的生长因子以及别的基质蛋白酶。肺间质纤维化

3、以及其他以纤维性变为特征的疾病被认为与纤溶酶原的活性被纤溶酶原激活物抑制剂．1(Plasminogenactivatorinhibitor-1，PAI．1)所抑制有关。PAI．1促进组织纤维化的机制还未完全清楚。动物模型已证实过度表达PAI．1基因的小鼠博莱霉素诱导后肺纤维化程度明显加重。RNAi的发现是生物界的一场革命，SiRNA技术是一种以调节转录后为目的的新型调控技术，通过合成特异性小分子RNA实现靶基因抑制，已作为基因功能研究和基因治疗的一种新手段。本研究中，我们利用PAl．1SiRNA来沉默博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型中的PAI．1基因的表达，观察肺纤维程度以及Cas

4、pase．3表达的变化。以便进一步研究肺纤维化的与凋亡的关系。方法：SD健康雄性大鼠72只，体重(200士20)g，采用随机数字表法将实验动物分成4组，盐水组(Sham组)、博来霉素组(B组)、BLM+P!AI．1SiRNA组(B+P组)和BLM+SiRNA阴对组(B+N组)，每组18中文摘要只。无水乙醚局部麻醉，仰卧位固定，常规消毒颈部皮肤，行颈正中切口，分离组织，暴露气管，B组、B+P组和B+N组按5mg／kg抽取BLM液0．2,-一0．3mL(生理盐水溶解)，穿刺并注入气管内，盐水组注入0．2"--0．3mL等体积生理盐水。B+P组每周两次气管内注入PAl．1SiRNA(7

5、．5nmol，0．2ml高压过的去离子水溶)，B+N组每周两次气管内注入阴对的SiRNA(7．5nmol，0．2ml高压过的去离子水溶)，Sham组和B组每周两次气管内注入0．2ml的生理盐水。上述4组动物分别于第7、14、28天每组各处死6只。右下肺固定于4％多聚甲醛，石蜡切片供组织学检查(HE染色，Masson染色)及免疫组化；右中叶留取做RealtimePCR和羟脯氨酸(HYP)的测定，行PCR的组织于液氮中保存，行HYP的组织于．80℃保存。通过HE染色，Masson染色和HYP的测定，来评价治疗效果，肺泡炎和肺纤维化程度用Szapiel法病理分级。免疫组化测定Caspa

6、se．3在肺组织的表达，并对Caspase．3积分光密度总和进行分析。RealtimePCR测定肺组织Caspase．3mRNA的含量。实验结果及数据资料采用Spssl3．0软件进行统计学分析。结果：l肺组织病理分析结果：B组各时间点的肺泡炎程度显著高于Sham组(P0．05)。2肺组织羟脯氨酸(HYP)含量的变化：B组大鼠肺组织

7、羟脯氨酸含量随造模时间的延长呈现逐渐升高的趋势，B组各时间点羟脯氨酸含量明显高于Sham组(P<0．01)，B+P组羟脯氨酸呈低水平升高趋势，各时间点羟脯氨酸含量均显著低于B组(PO．05)。3免疫组化结果：B组7天时Caspase．3表达较Sham组增加不明显，14天、28天较Sham组表达增加明显(P