hgf基因修饰bmscs治疗早期股骨头缺血性坏死的研究

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1、南方医科大学2009级博士学位论文HGF基因修饰BMSCs治疗早期股骨头缺血性坏死的研究TreatmentofearlystageavascularnecrosisoffemoralheadwithHGF·-transgenicBMSCs课题来源：国家863计划(NO：2007AA022458)专业名称免疫学学位申请人温茜指导教师马骊教授答辩委员会主席黎诚耀教授答辩委员会成员陈晓光教授王一飞教授邓诣群教授孟民杰教授论文评阅人何庆瑜教授陈政良教授董文其教授2012年5月26日广州HGF基因修饰BMSCs治疗早期股骨

2、头缺血性坏死的研究博士研究生：温茜指导教师：马骊摘要股骨头缺血性坏死(avascularnecrosisofthefemoralhead，ANFH)是临床多发病和常见病，致残率极高，多见于20．50岁青壮年，严重影响患者的生活质量和劳动能力，给社会和家庭造成巨大负担。据世界卫生组织不完全统计，全世界约有3000万人患有此病：我国患者约500．750万，每年新发病例15．20万，发病率呈逐年上升趋势。ANFH目前尚无特效疗法，已成为世界医学界亟待攻克的难题。寻找新的有效的早期治疗方法、保存自身股骨头显得尤为重要，其

3、潜在的社会和经济效益不言而喻。不论何种病因引起的ANFH，其根本原因是存在骨内压升高_÷血供障碍这一恶性循环。一般认为本病是一不可逆过程，因此，ANFH的治疗策略应该是早期治疗，降低骨内压、改善股骨头血供，打破恶性循环，同时进行坏死区骨质修复。利用血管生长因子诱导新血管生成和侧枝循环建立，是打破ANFH病理恶性循环最有效的手段，这也为ANFH治疗提供了新的研究方向。血管生长因子是一组可以诱导血管生成的细胞因子。不同的血管生成因子具有不完全相同的生物学活性，因此，选择何种血管生长因子至关重要。肝细胞生长因子(hep

4、atocytegrowthfactor,HGF)由间质细胞产生，具有很强的促血管内皮细胞(vascularendothelialcells，VECs)增殖和促血管生成作用，并可抑摘要制细胞凋亡和减轻组织纤维化，已在治疗缺血性心脏病和肢体动脉闭塞等疾病中展现出良好的应用前景，有望成为治疗ANFH理想的血管生长因子。骨髓基质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是一种由骨髓中分离获得的具有多种分化潜能的间质干细胞，是体内参与组织再生和修复的重要干细胞成分之一，取材方便，易于

5、被外源基因转染，同时还能分泌大量的促细胞和血管生长因子，其成分中含有骨祖细胞，具有良好的向成骨细胞分化的潜能。此外，BMSCs不具免疫原性，因此同种异体移植无免疫排斥反应，被认为是骨组织工程近阶段最有希望应用于临床的种子细胞。目前，用BMSCs治疗早期ANFH已显示出诱人的应用前景。将基因治疗和干细胞移植治疗相结合，用HGF基因修饰BMSCs治疗ANFH，比单用BMSCs具有明显的优势，表现在：(1)BMSCs在发挥其成骨能力的同时分泌HGF，诱导新血管生成，改善股骨头血供；(2)HGF对BMSCs有趋化作用，局

6、部高分泌的HGF可使BMSCs“停留”在坏死区局部，利于其向成骨细胞分化；(3)HGF能抑制BMSCs凋亡，其诱生的血管可改善移植细胞的生存环境，提高BMSCs移植存活率，进而提高治疗效果。本课题将基因治疗、干细胞移植、组织工程技术有机结合，以HGF为目的基因、以BMSCs为靶细胞，借助AdMax腺病毒载体系统，将HGF基因转入BMSCs；再以其为种子细胞，经髓芯减压隧道移植到股骨头坏死区，用于治疗早期ANFH。在减压的同时，移植细胞分泌的HGF诱导局部新血管生成和侧枝循环建立，改善股骨头血供：BMSCs在局部微

7、环境诱导下向成骨细胞分化，修复坏死区骨质，这种集减压、血管生成和骨质重建一体化的治疗技术，为ANFH治疗提供了一种全新的模式。目的在体外探讨HGF调节BMSCs增殖与成骨分化活性的方式与机制的基础上，评价HGF基因修饰BMSCs治疗早期激素性和创伤性ANFH的疗效，并初Ⅱ博士学位论文步探讨发病与治疗的分子机理。方法：1、分离培养与鉴定兔BMSCs取4．8周龄健康新西兰大白兔，麻醉后，于双侧髂后上棘行穿刺法抽吸骨髓，抗凝处理后低速离心去上清，以10％FBS．低糖DMEM培养液重悬培养，3d时换液去除未贴壁细胞，其后

8、每3d换液1次；待细胞汇合成单层后消化，传代细胞培养至第二代备用。采用诱导培养基体外诱导BMSCs向成骨细胞、成软骨、脂肪细胞分化。培养12和24天后，磷酸苯二钠基质(NBT-BCIP)法染色和茜素红(AR．S)染色以检测成骨分化水平；培养27天后，阿利新蓝染色以检测成软骨分化水平，油红O染色以检测成脂分化水平；同时以qPCR法检测BMSCs标志基因Vimentin、成骨