hgf调控tgf-β1诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制

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1、第二军医大学硕士学位论文HGF调控TGF--β1诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制姓名：孙月申请学位级别：硕士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：郑宏良20120529HGF调控TGF-B1诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制摘要目的建立一种高效的骨骼肌细胞分离培养的方法，并在此基础上观察转化生长因子．Bl(transforminggro叭h份ctorbeta．1，TGF．D1)诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用，探讨肝细胞生长因子(hepatoc”egr0州h伍ctor，HGF)调控TGF-pl诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制，为临

2、床治疗失神经喉肌纤维化提供一种新策略和理论依据。方法1、骨骼肌细胞的分离和培养实验组采用经腹主动脉Il型胶原酶灌注法消化骨骼肌，取材C57BL／6小鼠趾长伸肌，D．Hanks液冲洗后移入试管以I型胶原酶和lI型胶原酶联合振荡消化；对照组小鼠处死后直接取趾长伸肌，D．H锄ks液冲洗后用l型胶原酶振荡消化，以广口吸管研磨肌腹使肌细胞彻底松散。显微镜下对两种分离方法获得的骨骼肌细胞进行计数，各组均选取完整存活的肌细胞进行培养，不同时间点观察存活率。2、TGF．Bl诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制C2C12细胞以分化培养基诱导融合为肌管，

3、分化培养72小时后更换培养液为不含血清的DMEM，分别给予不同浓度TGF-p1(0n∥ml，0．1n∥ml，ln∥ml，5．Ong／m1)进行干预，12h后实时荧光定量PCR检测各组CTGF和洳SMA在转录水平的变化，WestembIot检测CTGF和a．SMA在蛋白水平表达变化。骨骼肌细胞分离后培养24小时，选取存活且状态良好的肌细胞随机分成实验组和对照组，实验组给予TGF．p1(O．5n∥m1)进行干预。12小时后实时荧光定量PCR检测各组CTGFmRNA和a．SMAmRNA的变化，Westemblot检测CTGF和仅-SMA蛋白

4、表达变化。3、HGF调控TGF．Dl诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制将分离培养的骨骼肌细胞随机分成三组：①空白对照组②TGF．Dl(O．5ng／m1)诱导组(HGF未干预组)③HGF(4ng／m1)和TGF-pl(O．5ng／m1)共同干预组，12小时后实时荧光定量RT-PCR检测各组CTGFmRNA和a．SMAmRNA的变化，间接免疫荧光法和WestembIot检测CTGF和a—SMA蛋白分布和表达水平。4、统计学方法所有实验结果数据以均数士标准差(x士s)表示。采用SPSS16．O统计软件行统计学处理。先进行各组方差齐性检验，

5、符合方差齐性条件，各组间均数比较采用单因素方第二军医大学硕士学位论文差分析(ANOvA)和t检验；不符合方差齐性条件，采用非参数检验。P

6、义(P<0．05)。但灌注法操作时间比研磨法长，且胶原酶消耗大，实验成本高。2、TGF—Bl诱导肌管纤维化转型作用及机制不同浓度TGF．D1干预下，肌管CTGF训RNA表达量较空白对照组均增高，在1n∥ml浓度时表达量最高为空白对照组的16．03倍，差异有统计学意义(P

7、，差异有统计学意义(P<0．05)；肌管a．SMA蛋白表达量较空白对照组均增高，在ln∥mI浓度时表达量最高是空白对照组的1．59倍，差异有统计学意义(P<0．05)。3、TGF．Bl诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制TGF．Bl诱导下骨骼肌细胞CTGFmRNA的表达是空白对照组9．55倍，a．SMAmRNA的表达是空白对照组26．82倍，差异有统计学意义(P<0．05)。TGF．Bl诱导下骨骼肌细胞CTGF蛋白的表达是空白对照组3．63倍，o【．SMA蛋白的表达是空白对照组3．38倍，差异有统计学意义(P

8、控TGF．p1诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制HGF干预后CTGF和a．SMAmI酬A的表达量明显下降，TGF．pl诱导组(HGF未干预组)CTGFmRNA表达量是HGF干预组6．57倍，TGF．D1诱导组(HGF