颞下颌关节滑膜细胞中prg4表达调控及tgf-β1诱导软骨化生作用机制研究

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1、浙江大学博士学位论文颞下颌关节滑膜细胞中PRG4表达调控及TGF--β1诱导软骨化生作用机制研究姓名：徐婷申请学位级别：博士专业：口腔临床医学指导教师：谷志远；林新平20120529浙江大学博七学位论文中文摘要颞下颌关节滑膜细胞中PRG4表达调控及TGF．pl诱导软骨化生作用机制研究浙江大学医学院口腔临床医学博士研究生徐婷指导教师谷志远教授林新平主任医师中文摘要颞下颌关节紊乱病(temporomalldibularjointdisorder，TMD)是口腔医学临床中常见病之一，尽管研究日益深入，但由于病因复杂，其发病机理尚未完全阐明。滑膜组织作为关节内重要

2、组成部分，在刚D发生和发展中起着重要的作用。目前，已有大量体外培养实验研究证实从滑膜组织分离培养的滑膜成纤维细胞(synovialfibroblasts．SFs)区别于从非滑膜部位分离的成纤维细胞，具有独特的生物学特性。本课题以大鼠颞下颌关节(temporom锄dibul盯joint，TMJ)双板区滑膜组织分离培养的SFs作为研究对象，分析SFs的润滑功能，成软骨分化及滑膜衬里重构的调控，以探讨sFs参与刑J的适应性改建，维持关节内环境稳定的相关分子机制。第一部分大鼠滑膜细胞PRG4表达调控机制研究目的：蛋白多糖4(proteoglycan4，PRG4)是

3、存在于关节滑液和软骨表面的大分子分泌糖蛋白，它在关节边界润滑体系中起主导作用，其表达在转录、蛋白合成、分泌等环节受应力和细胞因子的调控。本研究以原代培养的大鼠TMJ双板区的滑膜细胞为模型，观察相关细胞因子TGF．pl、TNF吨及应力负荷对滑膜细胞PRG4转录和合成分泌水平的影响，从生物力学角度初步探讨PRG4表达调控的分子机制。方法：取SD大鼠TMJ双板区平滑光亮的滑膜组织，采用组织块法分离培养滑膜细胞，并经免疫荧光细胞化学方法进行鉴定．利用实时荧光定量PCR技术检测不同浓度TGF．B1、TNF-0【及间歇静压力(inte珊inenthydrostatic

4、pressure，IHP)In浙江人学博：J二学位论文中文摘要作用下PRG4ml州A的表达；免疫荧光细胞化学、Elisa技术检测一定浓度的TGF．p1、TNF．0【及IHP作用下PRG4蛋白的表达。Westemblot和免疫荧光细胞化学技术分别检测Smad通路和P38MAPK通路相关蛋白在应力作用下表达，通过应用sB431542，观察阻断smad通路对应力诱导PRG4表达的影响。结果：所有培养的滑膜细胞均对cD68蛋白表达阴性，vimentin蛋白表达阳性，并具有成纤维细胞的特点，是滑膜成纤维细胞(Synovial舶roblaSts，SFs)。PRG4ml

5、ⅢA和蛋白表达水平随着TGF．p1浓度的增加和作用时间的延长而表达增多，呈现一定的剂量和时间依赖性；而不同浓度TNF．a对PRG4mIⅢA的表达均有抑制作用，其抑制效应呈剂量依赖性，且随着一定浓度TNF．0【干预时间延长，PRG4蛋白表达呈现一定的时效性。研究结果发现IHP和TGF—p1之间存在协同刺激PRG4mRNA和蛋白表达作用，同时lHP在一定程度上抵消了TNF．Q对PRG4表达的抑制作用。IHP作用使Smad2／3磷酸化水平的增加及Smad2／3蛋白核转位，但不能激活SFs内P38MAPK信号通路。应用SB431542阻断Smad通路能够抑制IHP

6、促进PRG4表达的效应。结论：适当的应力负荷可协同增强TGF．Dl对PRG4表达的正向调控作用，且能一定程度缓解炎症因子TNF．Q对PRG4表达的抑制作用。Smad信号通路是参与应力刺激对PRG4表达调控的一条重要途径。第二部分TGF—p1通过Rho～RocK通路调控滑膜细胞软骨分化的初步研究目的：SFs属于间充质来源细胞，具有软骨化生能力，在关节损伤后的修复及适应性改建过程中起到重要作用。转化生长因子-pl(t啪sfectgrowmf．acto卜Bl，TGF．p1)是关节软骨组织工程研究的首选生长因子，具有促进细胞增殖、细胞外基质的合成与分泌，调节骨及软

7、骨组织的修复重建作用。本研究通过TGF．Bl诱导大鼠SFs向软骨细胞分化，探讨RhoA依OCK信号通路在TGF—pl诱导的SFs表型转化及软骨相关基因表达调控过程中的作用及意义。方法：由大鼠聊J中分离培养sFs，在体外经TGF．B1诱导培养，采用RhoA活性测定及实时荧光定量PCR方法检测TGF．p1刺激前后细胞中ImoA瓜OCK信号通路的改变。荧光显微镜观察sFs骨架蛋白F．actin的改变。实时荧光定量PcR技术研究浙江人学博．I：学位论文中文摘要TGF．Bl诱导的sFs成软骨特征性基因(I型胶原、II型胶原、aggrecaIl和Sox9)表达的影响。

8、观察并比较加入特异性抑制剂hydroxyfasudil和Y2763