hgf调控tgfβ1诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制

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1、HGF调控TGF．131诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制摘要目的建立一种高效的骨骼肌细胞分离培养的方法，并在此基础上观察转化生长因子．131(transforminggrowthfactorbeta．1，TGF．p1)诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用，探讨肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)调控TGF-pl诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制，为临床治疗失神经喉肌纤维化提供一种新策略和理论依据。方法1、骨骼肌细胞的分离和培养实验组采用经腹主动脉Il型胶原酶灌注法消化骨骼肌，取材C57BL／6d,鼠趾长伸肌，D．Hanks液冲洗后移入试管

2、以I型胶原酶和lI型胶原酶联合振荡消化；对照组小鼠处死后直接取趾长伸肌，D．Hanks液冲洗后用l型胶原酶振荡消化，以广口吸管研磨肌腹使肌细胞彻底松散。显微镜下对两种分离方法获得的骨骼肌细胞进行计数，各组均选取完整存活的肌细胞进行培养，不同时间点观察存活率。2、TGF．131诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制C2C12细胞以分化培养基诱导融合为肌管，分化培养72小时后更换培养液为不含血清的DMEM，分别给予不同浓度TGF-131(On∥ml，0．1ng／ml，Ing／ml，5．0ng／m1)进行干预，12h后实时荧光定量PCR检测各组CTGF和a-SMA在转录水平的变化，W

3、esternblot检测CTGF和a．SMA在蛋白水平表达变化。骨骼肌细胞分离后培养24小时，选取存活且状态良好的肌细胞随机分成实验组和对照组，实验组给予TGF．p1(O．5n∥m1)进行干预。12小时后实时荧光定量PCR检测各组CTGFmRNA和0t．SMAmRNA的变化，Westernblot检测CTGF和a-SMA蛋白表达变化。3、HGF调控TGF．131诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制将分离培养的骨骼肌细胞随机分成三组：①空白对照组②TGF．Dl(O．5ng／m1)诱导组(HGF未干预组)③HGF(4ng／mI)和TGF-131(O．5ng／m1)共同干预组，12

4、小时后实时荧光定量RT-PCR检测各组CTGFmRNA和a．SMAmRNA的变化，间接免疫荧光法和Westemblot检测CTGF和Or,．SMA蛋白分布和表达水平。4、统计学方法所有实验结果数据以均数4-标准差(x士s)表示。采用SPSS16．0统计软件行统计学处理。先进行各组方差齐性检验，符合方差齐性条件，各组间均数比较采用单因素方第二军医大学硕士学位论文差分析(ANOVA)和t检验；不符合方差齐性条件，采用非参数检验。P<0．05，差异有统计学意义。结果l、两种分离方法获得的骨骼肌细胞的数量、生存率×5物镜下平均每个视野灌注法获得的肌细胞数为(32．17士2．09)根，

5、研磨法获得的肌细胞数为(10．58士1．15)根，差异有统计学意义(P<0．05)。24h灌注法肌细胞存活率是研磨法的3．20倍，48h灌注法肌细胞存活率是研磨法的2．76倍，72h灌注法肌细胞存活率是研磨法的2．75倍，各时间点生存率差异均有统计学意义(P<0．05)。但灌注法操作时间比研磨法长，且胶原酶消耗大，实验成本高。2、TGF—Bl诱导肌管纤维化转型作用及机制不同浓度TGF．D1干预下，肌管CTGFmRNA表达量较空白对照组均增高，在1ng／ml浓度时表达量最高为空白对照组的16．03倍，差异有统计学意义(P<0．05)；不同浓度TGF—Bl干预下肌管a．SMAmR

6、NA表达量较空白对照组均增高，在1ng／ml浓度时表达量最高是空白对照组的4．52倍，差异有统计学意义(P<0．05)。肌管CTGF蛋白表达量较空白对照组均增高，在lng／ml浓度时表达量最高是空白对照组的1．88倍，差异有统计学意义(P

7、0．05)。TGF．Bl诱导下骨骼肌细胞CTGF蛋白的表达是空白对照组3．63倍，a-SMA蛋白的表达是空白对照组3．38倍，差异有统计学意义(P<0．05)。4、HGF调控TGF．p1诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制HGF干预后CTGF和a．SMAmRNA的表达量明显下降，TGF．Dl诱导组(HGF未干预组)CTGFmRNA表达量是HGF干预组6．57倍，TGF—B1诱导组(HGF未干预组)a．SMAmRNA表达量是HGF干预组2．64倍，差异有统计学意义(P<0．05)。HGF干预后CTGF和