携带il-15t细胞对肝癌细胞体外杀伤的研究

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1、浙江理T大学硕十学位论文携带IL-15的T细胞对肝癌细胞的体外杀伤研究中文摘要肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocyte，TIL)是脱离血流后迁移至肿瘤组织的白细胞，主要由T细胞、B细胞和NK细胞组成。TIL对黑素瘤的过继治疗取得了很好的效果，而对肝癌的疗效并不理想，这可能与肝癌内TIL相对少见以及调节性T细胞的免疫抑制有关。TIL的分离和扩增方法以及快速扩增(rapidexpansionprocedure，REP)所需的大量IL-2和饲养细胞限制了这种过继治疗在世界范围内的推广。IL．15

2、具有刺激T细胞增殖，调节B细胞增殖和分化，提高NK细胞的杀伤活性并维持其存活，诱导细胞毒性T细胞的产生和杀伤活性，抑制活化T细胞的凋亡等功能。另外，IL．15可通过活化磷脂酰肌醇．3．激酶途径使淋巴细胞能抵抗调节性T细胞的抑制作用。本研究利用携带尼一J5基因的嵌合型腺病毒．腺相关病毒杂合载体Ad5／35．AAV-hIL．15转染TIL表达IL．15。5／35嵌合型腺病毒可以有效转染T细胞和NK细胞，AAV反向末端重复序列(invertedterminalrepeat，ITR)的引入可以使目的基因在细胞内持续稳定表达，突变胸

3、苷激酶(thymidinekinase，TK)基因的表达可以使细胞在加入丙氧鸟苷(gancyclovir，GCV)后发挥自杀功能。本研究用组织块培养获得了“年轻”TIL，并对TILREP中抗CD3单克隆抗体(OKT3)、IL．2及饲养细胞的用量进行了试验性摸索，发现OKT3用量增加并不会显著提高TIL的扩增倍数，而采用3000IU／mlIL．2或50倍于TIL的饲养细胞的扩增倍数分别与6000IU／ml和200倍的相当。最终，选择30ng／mlOKT3、3000IU／mlIL．2和50倍的饲养细胞进行TILREP，扩增达4

4、000倍以上。若用于REP的TIL细胞数不少于5×107，那么理论上扩增后TIL可达到2×10¨以上。对含尼．．75基因的质粒进行PCR，得到的目的基因产物与质粒pDC759．Tvl经EcoRI和BamHI酶切后连接，成功构建了质粒pDC759一hlL-15。质粒鉴定正确后与含35型腺病毒纤毛的腺病毒骨架质粒共转染293细胞，同源重组产生杂合病毒Ad5／35．AAV-hlL．15。该病毒充分结合了腺病毒和AAV的优势，能有效转染T细胞并稳定表达IL．15。采用CopGFP报告基因证实了载体Ad5／35．AAV对TIL的转染

5、效率明显高于Ad5．AAV。ELISA检测到病毒Ad5／35．AAV-hlL．15转染的TIL有目的蛋白IL．15的表达。MOI=1、10时病毒Ad5／35．AAV-hlL．15可促进TIL增殖，MOI=100时则对增殖不利。加入GCV后，I浙江理工大学硕士学位论文观察病毒Ad5／35．AAV-TK．CopGFP转染的SMMC-7721的绿色荧光及细胞形态，M丌法检测病毒转染后TIL的增殖情况，最终确认了病毒转染后突变TK的表达及其自杀功能。MOI=1、10时病毒Ad5／35．AAV-hIL．15转染的TIL对肝癌细胞SM

6、MC．7721的杀伤活性显著增强。i目前已完成大部分体外实验研究，还需用大规模REP检验初步优化的扩增条件。用流式细胞术检测TIL表型，弄清REP及病毒转染对TIL的影响。从肝癌组织建立原代细胞系，用对应的TIL在病毒转染后进行体外及小鼠荷瘤模型的杀伤实验。这些都是接下来要进行的工作。’关键词：TIL；杂合病毒；IL．15；肝癌；过继治疗Ⅱ浙江理T大学硕十学位论文CytotoxicityEffectofTCellsHarbouringIL一15onHepatoceUular^‘do’T●●‘CarcinomaCellLln

7、einvitroAbstractTumorinfiltratinglymphocytes(TILs)arewhitebloodcellsthathaveleftthebloodstreamandmigratedintoatumor,whichconsistmostlyofTlymphocytes，Blymphocytesandnaturalkiller(NK)cells．TheadoptiveimmunotherapyofmelanomausingTILhasachievedagoodgoal，whiletheeffect

8、onhepatocellurcarcinoma(HCC)isunsatisfactory．Thephenomenonperhapsinvolvestwoaspects，lowincidenceofTILsinHCCandimmunosuppressionofregulatoryTcells．Theapp