t—dna插入突变体在植物基因功能研究中应用

《t—dna插入突变体在植物基因功能研究中应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、T—DNA插入突变体在植物基因功能研究中应用摘要：在植物的基因克隆和功能分析研究中，有许多种策略，其中利用突变体是最常用的方法之一，但天然的突变体数量很少且难以发现，利用农杆菌介导的T-DNA标签法得到突变体［1］是目前研究植物功能基因组最有效、使用最广泛的手段，广泛应用于大规模植物基因功能分析，据统计有40%的拟南芥突变基因是用T-DNA标签法克隆的。关键词：T-DNA；突变体；基因克隆和功能分析根癌农杆菌介导的遗传转化由于操作简单、转化效率高、插入片段稳定性好、已被广泛应用于植物转基因研究。具体思路是将外源T—DNA转入植物基因组，以T—

2、DNA作为插入标记，来分离或克隆因为插入而失活的基因并研究基因功能。由于T—DNA左右边界及内部的基因结构是已知的，因此对获得的转基因T-DNA插入突变体就可以通过已知的外源基因设计引物，利用相应的PCR策略进行突变基因的克隆和序列分析，对比突变的表型进而研究基因的生理生化功能。1T-DNA插入突变简介T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能整合到植物基因组中并稳定地表达。T-DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。单拷贝T-DNA-旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便

3、于保存。早期研究认为，T-DNA在基因组中的整合是一个随机过程，没有明显的偏爱性。以T-DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。由于插入的T-DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR.质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。由此可见，T-DNA插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的

4、一种重要手段。1T—DNA标签的应用2.1大规模的植物基因功能分析大规模的植物基因功能分析目前使用最多的是插入突变的策略。由于农杆菌介导的T-DNA转化方法具有高效、重复性好、简便易行和表达稳定等优点[8],而且技术已经非常成熟，大多数植物都可以使用。此外T—DNA插入随机比,插入的位点可以贯穿整个基因组，甚至达到饱和，尤其像拟南芥这样的基因组很小的植物几乎可以标签到所有的基因。因此使用T-DNA作为插入突变源进行突变体的筛选并进行基因功能的研究在许多植物中应用并取得成功。现在拟南芥已经有几个大规模的T—DNA插入突变体库供人们进行研究,美国

5、Salk基因组分析实验中心的SalkT—DNA库就是其中之一。这些大规模的T—DNA插入库为拟南芥基因功能的进一步研究提供了有利的工具。2.2时空特异性启动子和表达基因的分离如果在插入T-DNA的一端安置一个报告基因，该报告基因没有启动子或只带有弱小的启动子，本身不表达或表达量极低。当这样的结构整合到宿主基因组时，如果报告基因位于内源启动子之下或者增强子附近，或者与内源的基因进行融合就被激活表达，并反映出正常内源基因的表达模式。利用该项技术(trappingvector)可以较方便地分离到一些特异性启动子和特异时空表达的基因，而不必一定要产生

6、突变表型。这种方法已经被成功地应用于植物启动子和基因的克隆中。Puzio利用启动子标签法标记到一个与线虫取食有关的基因pyk20,对该基因在各种外源激素处理和逆境胁迫反应中的基因表达模式进行研究发现，生长素、细胞分裂素和线虫取食处理植物可提高该基因的转录水平，而温度胁迫和外源ABA处理降低该基因的转录水平，分析携带gus基因的转基因系和野生型的序列，结果显示外源T-DNA插入到了该基因的启动子处。2.3T—DNA插入突变体库及侧翼序列库的构建T—DNA插入突变最大的用处是构建突变体库，在此基础上构建侧翼序列库；目前在拟南芥中已经建立了接近饱和

7、的T—DNA插入突变体库，该突变体库包含超过225000个独立的T—DNA插入株系，在预测的29454个基因中有21700个基因发生了插入突变［11］。含T〜DNA激活标签的拟南芥群体已经获得，并且在这些群体中已经获得大量的异常突变体和被标记基因。Sessiens等采用Ta订一PCR的方法分离了拟南芥插入突变体库85108条T—DNA侧翼序列。结果表明，平均约1000个拟南芥激活标签转化子能发现一个形态学突变。水稻中已建立了具有一定规模的突变体库，但远没有达到饱和的程度。水稻上大约获得了47932个T—DNA插入株系和3290个水稻激活标签转

8、化子，同时扩增出27621个侧翼序列。An等从6749个水稻标签系中分离了3793条T—DNA侧翼序列，并建立了侧翼序列数据库1T—DNA插入突变技术存在的问题及发