基于tnf-α跨膜段跨膜真核表达载体的构建与初步鉴定

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1、基于TNF—Q跨膜段的跨膜真核表达载体的构建与初步鉴定中文摘要【目的】1．诱导HL．60细胞表达肿瘤坏死因子，ImPCR扩增TNF．0【全长片段。2．构建带肠激酶酶切位点的TM．TNF．仅跨膜区连接TNF．a表达质粒pcDNA3．1．TM．enterokinase．TNF．a和带有FactorXa酶切位点的TM．TNF．a跨膜区连接TNF．a表达质粒pcDNA3．1．TM．FactorXa—TNF．0L。3．将已构建的pcDNA3．1-TM-enterokinase—TNF-a和pcDNA3．1一TM—Factor

2、Xa．TNF．0【表达质粒瞬时转染3T3细胞。4．验证融合蛋白表达情况。5．验证酶消化细胞的细胞液中是否存在TNF．a。【方法】1．用佛波酯和脂多糖诱导HL．60细胞表达mTNF．a，反转录扩增TM．TNF．仅cDNA。2．分别构建TM．TNF一仅全长序列的克隆质粒pcDNA3．1．TM．TNF．旺、带肠激酶酶切位点的TM．TNF—a跨膜区克隆质粒pcDNA3．1．TM．enterokinase、带有FactorXa酶切位点的TM．TNF。0【跨膜区克隆质粒pcDNA3．1．TM．FactorXa。通过重叠PCR将

3、已替换了enterokinase酶切位点和FactorXa酶切位点的跨膜段与s-TNF-aDNA片段连接后，插入pcDNA3．1(+)质粒以构建pcDNA3．1-TM．enterokinase—TNF．a和pcDNA3．1．TM．FactorXa．TNF-a表达载体。3．将己构建的pcDNA3．1一TM-enterokinase—TNF—a和pcDNA3．1一TM—FactorXa．TNF．0【表达质粒瞬时转染3T3细胞。4．通过I弭PCR鉴定mTNF．c【mI州A的表达。5．Westemblotting检测细胞总

4、蛋白中TNF．。【和胞外消化液中TNF-c‘表达。【结果】1．成功构建了TM．TNF．0【全长序列的克隆质粒pcDNA3．1．TM．TNF．Q。2．成功构建了带肠激酶酶切位点的TM．1NF．0【跨膜区克隆质pcDNA3．1．TM．enterokinase、带有FactorXa酶切位点的TM．TNF．a跨膜区克隆质粒pcDNA3．1．TM．FactoI．Xa、带肠激酶酶切位点的TM—TNF．0c跨膜区连接TNF．0【克隆质粒pcDNA3．1．TM．enterokinase—TNF．Q和带有FactorXa酶切位点的T

5、M．TNF-。【跨膜区连接TNF．0【克隆质粒pcDNA3．1．TM．FactorXa．TNF．c【。3．检测了重组质粒pcDNA3．1-TM·enterokinase—TNF-a和pcDNA3．1·TM-FactorXa．TNF．Q在3T3细胞中表达情况，两种质粒均能表达融合蛋白。4．pcDNA3．1．TM．FactorXa．TNF．0【质粒表达了跨膜的融合蛋白。【结论】成功构建了两种表达质粒，在3T3细胞中均可检测到融合蛋白的mRNA，Westemblotting也能检测出融合蛋白；其中pCDNA3．1一TM—

6、FactorXa．1NF．a质粒转染的细胞产生的融合蛋白是以跨膜形式存在，在相应的酶消化后，其胞外段的活性区脱落，形成了s．TNF．0【。【关键词】跨模型肿瘤坏死因子：跨膜蛋白；融合蛋白；重组；克隆；表达；DNA序列分析：蛋白质免疫印迹2ConstructionandidentificationofatransmembraneeukaryoticexpressionVectorbasedthemembranedomainofTNF—QAbstract【Objective】1．InduceedHL一60cellsto

7、expresstumornecrosisf．actor，andamplifiedTNF-amll—len砷fragIIlentbyRT·CPR．2．Const九lctedpcDNA3．1一TM-enterokinase·TNF一0【andpcDNA3．1-TM-Factorxa．TNF．a．3．TransientlytransfectedtheplasmidsofpcDNA3．1一TM-enterokinase-TNF-0【aIldpcDNA3．1一TM·FactorXa—TNFainto3T3cells．4．Ve

8、rifiedtheexpressionoffusionproteins．5．VerifiedthecellsapwhethertherewasTNF-0【aRerenzymedigestion．【Methods】1．InduceedHL-60cellsbyTPAandLPStoexpressmessagetumornecrosisfactor，andampl