rna干扰诱导马铃薯多酚氧化酶基因沉默的初步研究

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1、东北师范大学硕士学位论文1．1．3基因工程抑制果蔬褐化的研究1．1．3．1植物体内存在大量的酚类物质及多酚氧化酶植物体内存在大量的酚类物质，包括单酚类物质(酪氨酸、叶绿素等)，双酚类物质(儿茶酚、咖啡酸和绿原酸等)和多酚类物质(黄酮类、类黄酮类、二氢黄酮类等)。它们作为酚酶的底物，可以直接与相应的单酚酶(甲苯酚酶、酪氨酸激酶、漆酶等)，双酚酶(儿茶酚酶，咖啡酸酶等)和多酚酶发生酶促反应。通常，由于在所有植物体内存在量最多的酚类物质是黄酮类物质，所以将植物体内的酚酶统称为多酚氧化酶。1．1．3．2植物中存在的多酚氧化酶的分子生物学性质1895年，多酚氧化酶首次在蘑菇中发现，193

2、7年被分离得到晶体。实验证明，植物中的多酚氧化酶是一类由核基因编码的铜结合酶【3】。通常，无活性的多酚氧化酶前体在细胞质基质中被合成，它由N．端导肽部分、中间的铜结合区以及C端的疏水区组成，分子量在60．75kD。把不同种类的植物多酚氧化酶基因的序列进行比对，发现在大多数植物的中间铜结合区存在两个不连续的高度保守区域，一般记为CuA和CuB区。研究证明该保守区是酶的活性区域【4’5】。以章鱼的血蓝蛋白和成熟的儿茶酚酶的数据为基础，把通过3D软件得到的红薯的儿茶酚酶前体的结构作为模型【6，7】。把该模型与成熟的红薯的儿茶酚酶的晶体结构相比较，发现在前体的C端有一个由大约35个氨基

3、酸的组成的多肽。这段多肽可以在红薯多酚氧化酶基因的cDNA序列翻译得到，却在纯化的成熟蛋白中没有被检测到。可能是由于这段多肽在由前体被加工成成熟形式过程中被剪切掉了。研究表明，不同种类的植物的多酚氧化酶的生化性质是不同的，同种植物的多酚氧化酶基因的多基因家族的每个成员所表达的酶的性质也不同。通常多酚氧化酶的最适pH值范围为4．5．8．0，最适温度范围在25℃．30℃，分子量大小范围在40kD．70kD。在一些植物的同种组织中通过色谱层析技术分离得到了PPOI和PPOII两种类型的多酚氧化酶。通过SDS—PAGE，橡胶树(日P1，印6，伽Ⅳ跑瑚西)的PPOI和PPOII的分子量分

4、别是32kD和34kD，它们有相同的等电点、最适pH值和温度【8】。然而，在烟草中，以儿茶酚为作用底物的PPOI的最适pH值是7，而PPOII的最适pH值是6，同时还表明，PPOI的含量是PPOII的含量的10倍【91。1．1．3．3植物中多酚氧化酶基因的克隆与表达到现在为止，已经克隆到多酚氧化酶基因的植物有木瓜、荔枝、茶、红薯【10’111、番茄、大豆、马铃薯、葡萄、梅、苹果、甘蔗、烟草、杏、梨、桃、枇杷、白杨、香蕉‘121、菠萝‘41和咖啡【131。基因数量分析表明大多数的多酚氧化酶基因属于多基因家族。例如番茄中多酚氧化酶基因有7个，它们定位在8号染色体上【14】；马铃薯中

5、至少有6个多酚氧化酶基因；大豆3个㈣；小麦中2个【16】；香蕉中3个；例外的是葡萄只在2东北师范大学硕士学位论文叶脉中含有一个基因。传统上认为多酚氧化酶基因是没有内含子的，香蕉的基因中却有内含子【】到。有人认为内含子的存在可能会使多酚氧化酶基因沉默，然而到现在为止还没有这方面的实验证据。因此，报道的多酚氧化酶基因的数目可能还不是事实上真实的数量。不同种类植物的多酚氧化酶基因的表达方式不同。即使是相同植物的多酚氧化酶基因的同一种成员在相同组织和器官的不同生长期的表达也具有特异性，这可能是由于多酚氧化酶基因开关不同信号传导途径使传递因子与原位因素相互作用的结果【l8’191。多酚氧

6、化酶基因的表达具有时间和空间的差异性，同时形成的多酚氧化酶的数量与活性也不同。因此，多酚氧化酶的形成是一个复杂的代谢过程，具有重要的生物学功能，使植物可以对外界压力做出反应以适应预想不到的环境条件【20’211。1．2马铃薯薯块褐化1．2．1马铃薯的多酚氧化酶1992年，Kowalsl(i等为了研究马铃薯的野生种与栽培种在抗虫方面差异的机理，在马铃薯野生种的毛状体中提取了多酚氧化酶并分析了它的理化性质。结果发现野生种毛状体中多酚氧化酶的含量占总可溶性蛋白含量的70％，其等电点为5．5，相对分子量在59kD，作为一种单体的铜结合酶，常以绿原酸和咖啡酸为底物，发挥聚合作用，阻止昆虫

7、等通过叶片侵害植株。但是，利用由野生种制备的多酚氧化酶的多克隆抗体检测栽培种中的多酚氧化酶，发现栽培种毛状体中只有很少量的多酚氧化酶能与多克隆抗体发生交叉反应，同时检测出的多酚氧化酶活性很低【22】。2006年，利用两相系统方法提纯栽培种马铃薯的多酚氧化酶，发现多酚氧化酶的最适pH值范围在6．0．7．O【231。在离体的质体中观察马铃薯PPO的加工过程，发现马铃薯多酚氧化酶是一种质体酶，存在于细胞的叶绿体类囊体的囊泡和块茎细胞造粉体内。它的最适pH值为6．6，最适温度为30℃，等电点是5．5