有关实时荧光定量pcr技术的原理及其应用研究进展

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1、维普资讯http://www.cqvip.com第16卷第4期中国组织化学与细胞化学杂志V01．16．No．42007年8月CHINESEJOURNALOFHISTOCHEMISTRYANDCYTOCHEMISFRYAug．2007实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展赵焕英包金风(首都医科大学北京神经科学研究所，北京市神经再生修复重点实验室，教育部神经变性病重点实验室，北京100069)【关键词】实时荧光定量PCR；荧光标记探针；DNA结合染料[中图分类号)Q523．1[文献标识码)A自从1983年Mullis发明聚合酶链式反应lOnm)，报

2、告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸(polymerasechainreaction，PCR)以来，PCR技术收，并依赖其较高的S／N比值(信．噪比，signa1．很快成为科研、临床诊断的热点技术。但是传统to-noiseratio)和良好的辨别能力进行定量检测。PCR技术在应用中一是不能准确定量，二是容易1．2实时荧光定量PCR几个重要参数交叉污染，产生假阳性。直到近年来荧光共振能量①荧光域值(threshold)：以PCR反应的前15转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧

3、光域FRET)技术用于PCR定量后，上述问题才得到较值定义为3—15个循环的荧光信号的标准偏差的好的解决⋯。实时荧光定量PCR(real-timefluom-10倍。②Ct值：也称循环阈值，C代表Cycle，tgeneticquantitativePCR，FQ-PCR)是在PCR定性代表threshold。Ct值是指样品管的荧光信号达到技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在某一固定阈值的PCR反应循环数。在PCR循环过PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积程中，即荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲

4、线对拐点所对应的循环次数。在实际操作中，这个时刻未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性时刻，可见Ct值取决于阈值。③ARn：是指模板和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、DNA的起始拷贝数(图1所示)。经数学证明，Ct无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛值与模板DNA的起始拷贝数(ARn)成反比。典应用于分子生物学研究和医学研究等领域J。型的PCR分4给阶段(图2)。1．实时荧光定量PCR技术的概述1．1荧光共振能量转移原理1992年Higuc

5、hi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，荧光探针技术是基于标记基团的FRET原理而实现的，当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能图1实时荧光定量PCR几个重要参数Fig．1TheimportantparametersofrealtimePCR量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。在探针5’端标记一个报告基团(R)，在3’端标记一个淬灭基团(quencher，Q)，两者距离很近时(7-

6、[收稿日期]2006．10-31[修回日期]2007-01-26[作者简介]赵焕英，女(1975)，汉族，在读硕士研究生。图2典型的PCR分4个阶段十通讯作者(Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed)Fig．2The4phasesofrealtimePCR维普资讯http://www.cqvip.com第4期赵焕英等．实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展4932．实时荧光PCR的分类尊Reporter实时荧光PCR是在扩增产物聚集的过程中连．IIProbe◆●Quencher续检测，即“实时”检测，根据在指

7、数扩增期的产·—__________-—●物量来推算初始模板的拷贝数【3]。实时荧光定量与日栋序列互补PCR包括探针类和染料类两种，探针类是利用与靶图3TaqMan探针序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。染料Fig．3TaqManProbe类如SYBRGreenI则是利用与双链DNA小沟结合2．1．2TaqmanMGB发光的理化特征指示扩增产物的增加。前者由于增TaqmanMGB探针是Taqman探针的基础上改加了探针的识别步骤特异性更高；但后者则简便易进的，在探针的3’端增加了MGB(minorgroove行、成本较低。binder)分子，这种

8、物质能够结合在双链DNA小沟部位；MGB提高了探针的TM值，从而使它能2．1荧光标记探针够分辨1个碱基的差别