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1、氨基酸和生物资源2011,33(2):68~72AminoAcids&BioticResources实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用*钟江华,张光萍,柳小英(武汉大学后勤集团,武汉430072)摘要:实时荧光定量PCR技术(real-timefluorescentquantitativePCR,FQ-PCR)以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点在人类和动物疾病的快速检测、食品安全检测、定量分析、基因分型、基因表达研究、以及疫苗效力测定中成为分子生物学研究的重要工具,而且其定量范围极宽,无需做梯度稀释,特异性更强,
2、克服了假阳性。本文分别从实时荧光定量PCR技术的背景、原理、类型、技术优点和定量方法、实验条件和主要影响因素、应用前景以及存在的不足等方面作了一个综述。关键词:荧光定量;PCR;原理;应用中图分类号:Q53文献标识码:A文章编号:1006-8376(2011)02-0068-05随着基因诊断技术的不断发展和成熟,基因诊标记在探针的5端荧光报告基团(reporterR)未被断在临床中的地位显得更为重要。实时荧光定量标记在3端淬灭基团(quencherQ)抑制时,可检测PCR(real-timefluorescentquantitativepolymerase到
3、报告基团的荧光信号。检测到的荧光信号的强度chainreaction,real-timeFQ-PCR)技术于1996年与PCR反应产物的量成正相关,即每扩增一条DNA由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规与PCR产物的形成完全同步。PCR技术相比它所具有的特异性强、灵敏度高、重1.2定量原理复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反图1中x-轴表示PCR循环数,y-轴表示扩增应等优点使其很快成为科研、临床诊断的热点技术,反应的荧光值,与反应管中扩
4、增产物的量有比例关目前已得到广泛应用,包括对mRNA表达的研究、系。扩增曲线有指数增长期和非指数平台期2个阶各种基因定量分析、点突变分析和等位基因分析、单段。在指数增长阶段,每个循环PCR产物量大约增核苷酸多态性分析、DNA甲基化的检测及对各种传加一倍。然而随着反应的进行,反应体系组成成分染病进行定量定性分析。的消耗,反应进入平台期(图1中28~40个循环)。1实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1.1工作原理在常规PCR基础上
5、添加了荧光染料或荧光探针。而用于常规PCR的专门热循环仪配备荧光检测模块,可监测扩增时的荧光。荧光染料能特异性掺入DNA双链,发出荧光信号,而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号,从而保证荧光信号的增图1FQ-PCR扩增图加与PCR产物增加完全同步。荧光探针法是指当只有在荧光信号扩增期PCR产物量的对数值收稿日期:2010-10-14作者简介:钟江华,女(1968-),技师,协助从事病源微生物定量基与起始模板量之间存在线性关系,可以在指数期的因检测研究。某一点上来检测PCR产物的量,并由此推断模板最*通讯联系人Emai:lwangyefu@whu.edu.cn钟江
6、华等:实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用69初的含量。设定一定的荧光信号的域值(thresh个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行old)。如果检测到荧光信号超过域值,就被认为是定量分析的方法。探针类荧光标记物是利用与靶序真正的信号,它可用于定义样本的域值循环数Ct(C列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加,荧光染[1]代表循环cycle,t代表域值threshold)。Ct值的料是利用其它的一些理化特征指示扩增产物的增含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值加。前者因增加了探针的识别步骤,特异性更高;后时所经历的循环数。研究表明,每个模板的Ct
7、值与者的优点是简便易行。该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷2.1荧光标记探针贝数越多,Ct值越小。公式表示:Ct=-klogX0+b按其基团标记和能量转移的方式,目前已经开(X0指原始模板数)。利用已知起始拷贝数的标准发出几种相关的技术,大体可以分为水解探针和杂TM品可做标准曲线,只要获得未知样品的Ct值,即可交探针两类。TaqMan探针(水解探针)、TaqMan从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。MGB(水解探针)、Dual-oligoFRETpairs(双杂交探针)、MolecularBeacons(杂交探针)、ScorpionsTM2实时荧
