brd7基因在小鼠各组织中表达及基因敲除小鼠模型的构建

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1、原创性声明ifllHHIHfllllliHiIIIY2198910本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含有获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：关于学位论文使用授权恂说明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位

2、论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。本课题受如下基金资助：国家重大科学研究计划(资助号：2006CB910500)国家自然科学基金项目(批准号：81071686；81171934)硕士学位论文中文摘要摘要BRD7是我室自主克隆的一个鼻咽癌候选抑瘤基因，具有阻止细胞周期G1．S期进程、始动细胞凋亡、逆转细胞恶性生物学行为的特征。该基因能结合和识别乙酰化组蛋白H3，是Bromodomain家族成员之一。BRD7通过参与ras／MEK／

3、ERK、Rb／E2F和Wnt等多条信号通路实现抑瘤功能，是一个在鼻咽癌发病过程中与细胞周期和凋亡密切相关的核转录调节因子。尽管BRD7基因抑瘤功能和作用机制研究已经取得了突破性的进展，但仍然缺乏强有力的体内实验依据。新近发展的基因敲除技术是利用同源重组原理使特定的靶基因失活进而实现在其功能缺失的情况下分析靶基因功能的方法。通过基因剔除，可以从整体和细胞水平上反映基因剔除后一系列表型的改变。为此，本课题以C57BL／6小鼠为研究模型，一方面系统比较鼠源性BRD7与人BRD7基因在mRNA序列和氨基酸序列上的

4、同源性，并研究其在小鼠全身各组织中的表达规律；另一方面利用Cre／LoxP系统，探索基因剔除小鼠模型构建和鉴定的方法，构建BRD7条件性剔除小鼠模型，为体内研究BRD7的抑瘤功能、全面考察BRD7参与正常生理、疾病发生的功能和机制奠定坚实基础。具体实验结果如下：一．鼠源性BRD7的序列特征和表达1．鼠源性BRD7的序列特征C57BL是小鼠的一个品系，是一种常见的基因剔除研究动物模型。C57BL小鼠BRD7(mBRD7)的编码框序列为1956bp，含17硕士学位论文中文摘要个外显子，编码651个氨基酸。人B

5、RD7(hBRD7)的编码框序列同为1956bp，含13个外显子，亦编码651个氨基酸。mBRD7的mRNA和氨基酸序列与hBRD7的同源性均高达88％，说明C57BL小鼠中BRD7发挥的功能与人体组织中BRD7发挥的功能类似，是BRD7基因剔除小鼠构建的最佳小鼠品系。2．mBRD7在小鼠全身各组织中的表达规律研究通过数字化表达分析(电子杂交)，mBRD7在脑、眼睛、心脏、肝、肺、胰腺、皮肤、睾丸、肠、血液、骨和前列腺等表达水平较高，在肌肉、唾液腺、胃等组织中表达较低，是一个存在广泛表达的保守基因。进一步

6、通过荧光定量PCR检测，发现mBRD7的平均CT值为24．2个循环，GAPDH的平均CT值为19．0个循环，其mRNA表达水平是GAPDH的1／36．76。BRD7在小鼠全身各组织中整体表达处于中低度水平，呈泛表达，但在睾丸、附睾、精囊腺、生精管等雄性生殖相关的组织以及脾、肺、外耳等组织中表达较高，推测BRD7可能与小鼠雄性生育存在某种关联。二．BRD7基因剔除小鼠模型的构建1．BRD7LoxPl．2蚺小鼠的构建和鉴定LoxP插入的杂合子小鼠(Flox小鼠)是条件性基因剔除小鼠过程中的重要步骤，系与上海南

7、方模式生物研究中心合作完成。整个制备过程包括条件性打靶载体的构建、胚胎干细胞的基因打靶、阳性ES细胞克隆的筛选、重组ES细胞囊胚腔注射、嵌合体小鼠的获得等，通过毛色和基因型鉴定获得LoxP插入的杂合子小鼠(BRD7一LoxPl．2弘小鼠)。在获得BRD7LoxPl．2“小鼠的基础上，抽提小鼠尾巴gDNA，分别采用两对针对LoxPl、LoxP2位点的引物和针对野生型等位基因(WT)的引物进行PCR扩增和测序鉴定，证实BRD7LoxPl．2+／=／J-、鼠硕士学位论文中文摘要构建成功。2．BRD7LoxP3+

8、／+／1x鼠的构建和鉴定取BRD7LoxPl-2+／'／1x鼠雌雄杂交，分别以子代鼠gDNA为模板，采用针对LoxPl、LoxP2和WT的引物进行PCR扩增鉴定，获得基因型为BRD7LoxPl．2+／+／JN鼠；然后与EII．Cre+／+d,鼠杂交，通过PLoxPl、PLoxP2、PLo)(P3、PWT和Pc托五对引物对子代鼠进行PCR扩增和鉴定，获得基因型为BRD7LoxP3“Cre+／。小鼠；再进一步与基因型为BRD7lo