iras基因敲除小鼠构建及相互影响蛋白筛选

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1、IRAS基因敲除小鼠构建及相互影响蛋白筛选前言自可乐定的降压作用被发现以后，人们研究表明它可以通过降低血清中儿茶酚胺的浓度而使血压降低。最早提出咪唑啉类化合物概念的是Ruffolo[1]，他发现咪唑啉类衍生物特拉唑嗪可以拮抗羟甲唑啉引起的平滑肌收缩作用，而对苯乙胺类去甲肾上腺素类药物（如甲氧明、去氧肾上腺素等）引起的平滑肌收缩无效。1984年，Bousquet在麻醉猫的延髓头端腹外侧（RVLM）微注射可乐定发现可引起降压作用，而同样方式给予2肾上腺素受体激动剂没有产生降压作用，由此发现了咪唑啉受体的存在[2]；其后Ernsberger也采用放射性配体结合实验证实在相同脑区有咪

2、唑啉特异性结合位点[3]。1.咪唑啉受体相关研究在咪唑啉受体结构和功能方面：人们最初发现了两个不同的咪唑啉受体亚型。研究较清楚的是I2咪唑啉受体，最早称为I2咪唑啉结合位点，根据对阿米洛利亲和性的不同又将其分为两个亚型，I2A和I2B；在脑、肝、肾等组织均有分布。Tesson等研究发现，I2咪唑啉受体主要定位于细胞线粒体外膜上[4]；后证实I2咪唑啉结合位点是单胺氧化酶（MAO）的调节亚基[5]。I1咪唑啉结合位点是可乐定高亲和力结合位点，主要分布于皮层和延髓腹外侧。I1咪唑啉受体激动剂主要作用于该受体，通过激活磷脂酶C活化MAPK，进而激活ERK产生生物学效应；其最主要的作

3、用是中枢血压调节[6]，研究表明I1咪唑啉受体激动剂的降压过程中还有S1P受体[7]以及G蛋白偶联的内向整合钾通道参与[8]，同时在RVLM脑区有c-jun基因表达的下降[9]。此外采用药理学研究技术发现，利美尼定肾脏灌流，在不影响血压的前提下具有排钠利尿作用[10]，推测肾脏中也存在I1咪唑啉受体[11]。莫索尼定还能抑制胃腺分泌、保护胃粘膜[12]，抑制大鼠胰岛素的分泌等[13]。在咪唑啉配体方面：1994年，作为一种可乐定替代物质（clonidine-displacingsubstance，CDS），Li等从牛脑中纯化得到了胍丁胺，它可以与2-肾上腺素受体以及咪唑啉受体

4、结合，刺激肾上腺髓质嗜铬细胞分泌儿茶酚胺；以后研究发现脑内存在胍丁胺合成所需的左旋精氨酸脱羧酶。因此，研究者首次提出胍丁胺是咪唑啉受体的内源性激动剂[14]。1996年，Kolesnikov等首次报道胍丁胺能增强阿片镇痛、对抗阿片耐受作用[15]。本课题组前期对胍丁胺的药理学作用开展了深入细致地研究。首先，我们研究发现在小鼠醋酸扭体模型上外源性胍丁胺本身具有弱的镇痛作用（ED50=10.4mg/kg）；在小鼠热辐射甩尾试验中，胍丁胺可以协同吗啡的镇痛作用；另一方面，外源性胍丁胺可以逆转和预防吗啡引起的耐受、躯体依赖和精神依赖；咪唑啉受体拮抗剂咪唑克生能够抑制胍丁胺的上述药理作

5、用[16,17]，表明胍丁胺的作用可能与激活咪唑啉受体相关。我们采用药理学的方法上调或下调内源性胍丁胺水平后，发现阿片的药理作用同样受到了影响：使用左旋精氨酸脱羧酶抗体抑制胍丁胺的合成后，可使吗啡的镇痛作用减弱、并加重了吗啡耐受；相反，当用胍丁胺酶抑制剂二氟甲基鸟氨酸或氨基胍使内源性胍丁胺水平升高后，吗啡的镇痛作用得到加强而吗啡诱导的耐受则受到抑制[18]。上述结果从两方面说明，内源性和外源性胍丁胺对阿片受体系统的药理学作用具有双向调节作用，即一方面增强阿片的镇痛作用，另一方面能抑制阿片诱导的耐受和依赖。由于胍丁胺被认为是咪唑啉受体的内源性配体，而且I1咪唑啉受体拮抗剂咪唑克

6、生能够对抗胍丁胺的上述作用，提示我们胍丁胺的这种作用可能是通过I1咪唑啉受体介导的。2.IRAS蛋白的发现及其结构和功能研究IRAS蛋白的发现：在上述药理学研究工作的基础上，国内外部分学者开始将研究重点放在寻找咪唑啉受体蛋白上。1998年，Ivanov制备了两种抗体，一种于亲和纯化的咪唑啉结合蛋白，另一种则于抗咪唑啉类化合物的抗体。虽然不同，但采用两种抗体同时在多种组织中检测到了85kD的ain，是细胞内常见的蛋白功能结构域[39]，介导信号转导、囊泡转运、蛋白分选等多种生理功能。所以该功能残留是可以接受的。第二部分相互作用蛋白的筛选....741.材料方法......741

7、.1.质粒构建........741.2.酵母双杂交......751.2.1.试剂....751.2.2.酵母双杂交的基本流程......761.2.3.酵母转化流程：......761.2.4.文库筛选......771.2.5.自激活鉴定....771.3.免疫共沉淀......771.3.1.试剂材料......771.3.2.免疫共沉淀步骤......781.4.荧光能量共振转移（FRET）....781.5.哺乳动物双杂交........781.5.1.试剂仪器......781.5.2.操