TALEN-小鼠-基因敲除流程.pdf

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1、上海斯丹赛生物技术有限公司SIDANSAIBiotechnologyCO.,LTD小鼠：分类：小鼠属于哺乳纲（Mammalia）、啮齿目（Rodentia）、鼠科（Muridae）、小鼠属（Mus）动物。特征：生长期短、成熟早、繁殖力强。性成熟：6~7周。雌性35～50日龄，雄性45～60日龄；体成熟：雌性为65～75日龄，雄性为70～80日龄；性周期为4～5天，妊娠期为19～21天；哺乳期为20～22天；一次排卵10～23个（视品种而定），每胎产仔数为8～15只，一年产仔胎数6～10胎，属全年、多发情性动物，繁殖率很高，生育期为一年。确定靶基因

2、同源重组介导的小构建同源重组载体鼠基因打靶流程载体线性化导入ES筛选同源重组成功的ESES显微注射囊胚野生型F0代（嵌合体）野生型野生型F1代（杂合体）F1代（杂合体）野生型F2代（杂合体）F2代（纯合体）确定靶基因TALEN介导的小构建TALEN载体鼠基因打靶流程TALEN活性检测小鼠3T3细胞体外转录mRNA注：KI加同源载体DonorDNA将mRNA注射入一细胞期受精卵野生型F0代（嵌合体）野生型野生型F1代（杂合体）F1代（杂合体）野生型F2代（杂合体）F2代（纯合体）Step1设计TALEN打靶载体针对靶基因的两个不同位点分别设计一个

3、2X3的TALEN组合5’3’3’5’Spacer12-21bpStep2构建TALEN打靶载体通过FastTALETM一步连接法完成TALEN载体的构建上游引物测序结果比对下游引物测序结果比对Step3细胞水平TALEN活性验证Day1:小鼠3T3细胞铺板筛选出一对高活性的TALEN质粒用于后续实验Day2：Fugene共转TALEN左右臂质粒和EIP质粒①PCR产物测序结果②PCR产物进行TA克隆查看套峰测序，计算突变率Day3:药物筛选（puromycin,1μg/ml）Day6:收集剩余细胞,PCR靶向序列片段，抽基因组DNA扩增出50

4、0bp左右在靶位点上下游设计PCR引物，对打靶后的细胞基因组DNA进行PCRPCR-FTALEN-L>200bp>200bpTALEN-RPCR-RMarker560bp目的基因片段PCR扩增活性检测方法①：PCR产物测序结果查看峰图方法：TALEN质粒转染细胞药物筛选，收集细胞提取基因组DNAPCR扩增PCR产物测序打靶效率中等的样品活性检测方法②：PCR产物连T载体，单克隆测序计算突变率挑取30-50个克隆，将测序结果与目标基因的原始系列进行比对，计算突变率。注：图中第一排WT为原始序列，---表示缺失，红色为插入或置换。Step4体外转录

5、生成mRNATALEN质粒线性化根据载体所带启动子选择相应试剂盒进行体外转录mRNA浓度、纯度检测原核启动子：sp6或T7mRNA转录后的大小检测：若片段大于1.5kb可用琼脂糖凝胶电泳检测；若片段较小，建议用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。Step5胚胎注射mRNATALEN左右臂注射至一细胞移至代孕雌鼠37℃培养24hmRNA按1:1期受精卵中，至小鼠至二细胞期比例混合细胞质中出生（3周）注射浓度300-500ng/ul注射体积：5-15plStep6F0代突变体小鼠检测T7E1酶切鉴定法：F0代小鼠剪尾，抽提基因组DNA剪小鼠的尾巴或脚趾提取基因组

6、DNAPCR靶向基因序列PCR扩增靶基因位点PCR产物于94℃失活、50-60℃退火T7E1酶切鉴定PCRT7E1酶37℃作用1h产物，进行初步筛选琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物连TA克隆进行测序，进一步确认F0代突变体小鼠Step7获得F1代杂合体小鼠F0代突变体小鼠x野生型小鼠F1代杂合子小鼠F1代小鼠剪尾，抽提基因组DNAPCR靶向基因序列通过PCR产物测序查看峰图及TA克隆测序结果比对，鉴定F1代杂合体小鼠同源重组介导的knockoutTALEN介导的knockoutanimalmodelanimalmodel经由ES，同源重组打靶得到Kn

7、ockout无需经过ES阶段，直接注射到胚胎ES细胞系后，再注射到囊胚进行打靶打靶效率高打靶效率低TALEs特异性识别DNA碱基序列，Fok1切断双链DNA从而造成双链断裂细胞内自然发生的同源染色体随机交换，(DSB)，引入的DSB激活的DNA自我修复引起基因的突变和促进靶位点DNA打靶效率通常只有10-6至10-8同源重组。外源引发DNA断裂，几率高，提高几百倍甚至千倍knockout不需要同源序列同源臂很长，一般3-5kb,克隆困难knockin同源序列1k以内，易于克隆周期长：12-18个月周期短：6-10个月成本高：12万成本低：10万S

8、IDANSAIBiotechnologyCO.,LTDwww.sidansai.com